Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare in laboratorio. Per questo scopo si devono conoscere quali.

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2 Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare in laboratorio Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritizie e quali condizioni fisiche essi richiedono

3 COLTIVAZIONE DEI BATTERI La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l impiego di terreni di coltura sterili con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare

4 I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare

5 Deve,inoltre, contenere substrati ossidabili donatori di H, sotto forma di sostanze inorganiche per i batteri chemioautotrofi e di sostanze organiche per i microrganismi chemioeterotrofi fonti di C organiche (carboidrati) o inorganiche (carbonati) e fonti di N organiche (R-NH 2 ) o inorganiche (NO 3, NO 2, N). fonti di accettori di H: ossigeno per gli aerobi e solfati, nitrati o carbonati per gli anaerobi

6 Se necessari devono essere presenti fattori di crescita, ossia metaboliti essenziali che il microrganismo non può sintetizzare, siano essi aminoacidi, vitamine o precursori di acidi nucleici. Sali minerali, forza ionica, ph, tensione parziale di ossigeno e temperatura di incubazione sono tutti fattori critici che vanno attentamente regolati per ottenere una crescita batterica ottimale.

7 Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi, in quantità notevoli: si tratta di quelle che sono necessarie per le biosintesi e che entrano quindi a far parte delle principali componenti strutturali della cellula, come carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici Queste sostanze vengono definite: Macronutrienti CARBONIO AZOTO OSSIGENO IDROGENO ZOLFO FOSFORO servono per la sintesi dei componenti strutturali della cellula

8 In un secondo gruppo di macronutrienti si trovano gli elementi usati in quantità relativamente elevate rispetto agli altri sali. La maggior parte di queste sostanze è necessaria a tutti i batteri, ma alcune sono fondamentali soltanto per alcune specie o in particolari momenti

9 Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue: generalmente le tracce contenute in sali o nell acqua sono sufficienti a garantire la crescita del microrganismo Se tuttavia si usano sali e acqua particolarmente puri, questi elementi devono essere aggiunti ai terreni sotto forma di soluzioni bilanciate Queste sostanze vengono definite: Micronutrienti

10 I terreni che si usano in batteriologia devono: contenere tutti i nutrienti necessari alla crescita dei batteri da coltivare l acqua disponibile deve essere adeguata, il ph deve essere intorno a 7.2 a meno di richieste particolari. Anche la temperatura e l areazione sono importanti. Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza limiti spaziali) o solidi

11 Per solidificare i terreni si impiega L AGAR L agar è un polisaccaride, estratto da alcune alghe rosse, che si liquefa a 100 C e resta liquefatto fino alla temperatura di 45 C. L uso dell agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare. Una sospensione sterile di agar all 1,5-2% può essere raffreddata a 50 C, versata nei contenitori appropriati e poi gelificata portandola al di sotto di 45 C. non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;

12 Un ottimo e semplice metodo, adatto per molte specie, è la conservazione di una coltura a becco di clarino sotto olio di paraffina sterilizzato. Questa tecnica, oltre a permettere la conservazione anche per parecchi anni, presenta il vantaggio di poter prelevare un po' di coltura con un'ansa di platino sterile, senza che sia poi necessaria alcuna operazione di ripristino della coltura da conservare. La coltura a becco di clarino presenta, inoltre, un altro vantaggio che è quello di avere a disposizione una maggiore superficie di semina.

13 i microrganismi invisibili ad occhio nudo (<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione su substrato solido o liquido

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15 Preparazione dei terreni 1. Dissoluzione degli ingredienti in volume di H 2 O. 2. Determinazione del ph ed eventuale correzione. 3. Distribuzione in contenitori idonei. 4. Sterilizzazione

16 In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono classificati come: Terreni minimi Sintetici (o definiti) Complessi Terreni minimi Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono aggiunti come sali inorganici in concentrazione nota. In questi terreni possono crescere solo i batteri chemioautotrofi.

17 Terreni sintetici o definiti I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera far crescere. Sono costituiti, oltre che da acqua, da composti organici ed inorganici addizionati a concentrazione nota, quali fonti di C, N, S, P che di aminoacidi, basi azotate e vitamine, indispensabili per la sintesi di proteine, acidi nucleici e necessari come catalizzatori di reazioni metaboliche.

18 Terreni complessi sono quei terreni ricchi di substrati organici di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica (estratto di carne, di organo, di lievito, di embrione, di sangue, liquido ascitico) Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in quanto permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro Inoltre è possibile crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute. Oltre alle sostanze standard i terreni complessi contengono: Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate altrimenti denaturerebbero ad alte temperature); Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi, peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell azoto.

19 I caratteri colturali forniscono indizi utili per l identificazione COLONIE SU AGAR ACCRESCIMENTO SU AGAR A BECCO DI CLARINO ACRESCIMENTO SU BRODO NUTRITIZIO ACCRESCIMENTO PER INFISSIONE IN GELATINA

20 Caratteristiche visive dell avvenuto accrescimento in brodo

21 Crescita in terreni solidi (piastre Petri)

22 Crescita in substrati solidi (agar becco di clarino)

23 POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche popolano contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua). COLTURE MISTE

24 PER STUDIARE I DIVERSI BATTERI CHE COLONIZZANO UN HABITAT O PER ISOLARE UN PATOGENO BISOGNA ISOLARE E COLTIVARE IN FORMA PURA IL MICRORGANISMO Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un unica cellula madre Essa rappresenta una condizione artificiale per l accrescimento dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio

25 Classificazione qualitativa dei terreni Terreni elettivi Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di interesse medico, molto esigenti dal punto di vista nutrizionale. Terreni selettivi Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie. Terreni differenziali Sono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata. Terreni di arricchimento Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.

26 Terreni selettivi Favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo delle altre specie. Alcuni esempi di fattori inibenti possono essere: Cristalvioletto: inibisce i batteri Gram+ Verde brillante: inibisce i batteri Gram+ e la Shigella Cetrimide: favorisce la crescita dello Pseudomonas aeruginosa Sodio azide: inibisce a seconda delle sue concentrazioni: se la concentrazione è bassa viene inibita la crescita dei Gram-, se la concentrazione è elevata vengono inibiti anche i Gram+. Antibiotici: inibiscono la crescita dei batteri, favorendo quella di lieviti e muffe Cloruro di sodio: a concentrazioni elevate (>3%) inibisce la maggior parte dei microrganismi (esclusi stafilococchi) Sali biliari: inibiscono a seconda della loro purezza: se non sono purificati inibiscono i batteri non enterici (ad eccezione degli enterococchi), se vengono purificati e frazionati inibiscono ogni batterio non enterico.

27 Terreni selettivi Esempio di un terreno selettivo è l agar MacConkey e il terreno EMB (eosin methykene blue) contenenti coloranti che inibiscono la crescita dei batteri Gram positivi, favorendo lo sviluppo dei batteri Gram negativi

28 ESEMPIO DI TERRENO DIFFERENZIALE a - b - g - emolisi su piastra di agar sangue

29 ESEMPIO DI TERRENO SELETTIVO E DIFFERENZIALE Fermentazione del mannitolo in piastra di MSA da parte di S. aureus e non di S. epidermidis. La presenza di un indicatore di ph come il rosso fenolo, consente di discriminare tra le due specie batteriche grazie al viraggio dell indicatore di ph in casi di crescita di S.aureus

30 TERRENI SELETTIVI E DIFFERENZIALI

31 ASETTICITA' Le finalità: ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi Una coltura pura è costituita solo da una specie di microrganismo. La contaminazione delle colture è a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sulla pelle, nell aria. svolgere il lavoro in un laboratorio di microbiologia in sicurezza

32 Le regole fondamentali di asetticità sono: la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente sterilizzare la vetreria e il materiale usato disinfettare e pulire il banco da lavoro accuratamente sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto