OGM e Micotossine: stato della ricerca

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1 OGM e Micotossine: stato della ricerca Relatore: Francesco Pazzi Ottobre 2007

2 Riassunto Le micotossine sono prodotti del metabolismo secondario di alcuni miceti filamentosi con caratteristiche chimico-fisiche e tossicità diversa che, una volta assunte dall organismo umano ed animale, possono essere metabolizzate nei diversi tessuti recettivi ed esplicare, in questo modo, il loro effetto tossico che, nel peggiore dei casi, può condurre fino alla formazione di carcinomi agli organi colpiti. La loro presenza negli alimenti è perciò sgradita e può limitarne la commerciabilità causando ingenti perdite economiche. Viste le caratteristiche delle muffe, la presenza di prodotti contaminati da micotossine può essere rinvenuta in ogni punto della filiera alimentare. Inoltre, l elevata stabilità delle micotossine, fa si che i metodo di decontaminazione dei prodotti siano quasi del tutto inefficienti. Per cui la prevenzione nelle diverse fasi della filiera alimentare risulta l unico mezzo attualmente disponibile per la prevenzione del rischio. Nella fase di campo, uno dei metodi per combattere le contaminazioni, è quello di utilizzare varietà resistenti agli insetti e ai patogeni fungini. Le ferite inferte dagli insetti sono infatti uno dei principali mezzi di inoculo delle muffe. L entrata in commercio di piante di mais Bt (Bacillus thuringensis) che esprimono l endotossina Cry specifica per alcuni tipi di Lepidotteri e Coleotteri, ha portato diversi ricercatori a studiare la diminuzione di micotossine ottenibile attraverso l utilizzo di ibridi Bt rispetto alle corrispettive piante isogeniche. Il presente lavoro analizza quali sono le prospettive della ricerca nel campo dell ingegneria genetica per la prevenzione del rischio da micotossine e quale sia l efficacia delle tecnologie introdotto sino ad ora sul mercato mondiale, con particolare riferimento al mais Bt. I risultati dell analisi mostrano che nonostante l ingegneria genetica delle piante abbia aperto interessanti prospettive di ricerca nel campo della lotta alle micotossine, ad oggi, gli strumenti messi a disposizione per ridurre il rischio nella filiera agroalimentare sono limitati e rivolti ai soli presunti effetti del mais Bt sul contenuto di fumonisine nella granella. Inoltre, diversi lavori hanno evidenziato che numerosi fattori abiotici e biotici sono in grado di mitigare tale efficienza in un reale contesto colturale.

3 INDICE 1. Introduzione Patogenesi e micotossinogenesi Metabolismo delle micotossine e loro effetto tossico Limiti di legge per le micotossine nei prodotti alimentari Le prospettive della ricerca I prodotti in commercio Analisi dei lavori Effetti del mais Bt sulle micotossine Effetti del mais Bt su aflatossine, tricoteceni e zearalenone Effetti del mais Bt sulle fumonisine Fattori mitiganti l efficienza della tecnologia Bt in un reale contesto colturale Influenza dell inserto e della linea parentale trasformata Popolazioni d insetti e funghi patogeni predominanti ed interazione tra essi e la pianta Condizioni climatiche e ambientali Conclusioni...27

4 1. Introduzione Le micotossine sono prodotti del metabolismo secondario di alcuni miceti filamentosi, con tossicità e caratteristiche chimico-fisiche diverse che, una volta assunte dall organismo umano ed animale, possono essere metabolizzate nei diversi tessuti bersaglio ed esplicare in questo modo il loro effetto tossico. Gli effetti sono variabili in funzione del tessuto colpito, della quantità ingerita, degli animale interessati, del tipo di micotossina e di numerosi altri fattori e possono condurre fino alla formazione di carcinomi (Coulombe, 1993). Le muffe produttrici di micotossine sono ubiquitarie, quindi, possono essere rinvenute su quasi tutte le colture d interesse agrario ed in ogni punto della catena alimentare. I miceti produttori delle principali micotossine (aflatossine, fumonisine, tricoteceni, ocratossina A e zearalenone) che si possono riscontrare nei cereali sono riconducibili essenzialmente a tre generi: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. La prevenzione nei diversi livelli della filiera alimentare è di fondamentale importanza e passa attraverso un approccio integrato atto all utilizzo delle buone pratiche agricole e produttive necessarie per prevenire le cause che possono determinare l attacco fungino (corrette pratiche agronomiche, scelta varietale, tempo di raccolta, corretta essiccazione, condizioni igienico sanitarie adeguate nelle fasi di trasporto, stoccaggio e lavorazione, controlli analitici del materiale grezzo in entrata, ecc.). Comunque, le caratteristiche delle muffe e dei loro complessi meccanismi di interazione con l ambiente, fanno sì che la difesa delle colture dalle malattie fungine sia estremamente difficile. Infatti, le diverse interazioni tra pianta e patogeno sono molto diversificate, non solo in relazione alle modalità di penetrazione dei miceti, ma anche alla complessa diversificazione e fluttuazione delle popolazioni fungine che si verificano nello spazio e nel tempo, in conseguenza sia delle variazioni climatiche e ambientali che delle stesse colture presenti in campo. Per questo motivo, l introduzione di un solo gene di resistenza non è sufficiente per difendere la pianta da tutte le possibili specie o razze fungine che possono infettarla, comprese quelle resistenti che possono differenziarsi in seguito a forte pressione selettiva. La legislazione comunitaria, allo stato attuale, ha previsto la regolamentazione solo di determinati gruppi di micotossine, in relazione a specifiche tipologie di prodotti, mentre, per altri, non ha ancora stabilito dei limiti precisi (Tab. 1). Un punto centrale del dibattito tra i diversi attori coinvolti nella catena alimentare è quello relativo alla possibilità di ridurre, attraverso l utilizzo di Piante Geneticamente Modificate (PGM), il problema delle micotossine nelle derrate agricole. Grazie ad un approccio biotecnologico integrato atto alla produzione di piante resistenti agli insetti, ai funghi patogeni e in grado di detossificare le micotossine, sarebbe possibile eliminare rispettivamente: il vettore di inoculo, i patogeni produttori 1

5 di micotossine e le tossine stesse, cioè, ridurre notevolmente la contaminazione da micotossine almeno fino alla fase di raccolta (Duvick J., 2001). Tab.1: caratteristiche delle principali micotossine che interessano i cereali. Cond. di sviluppo: Fungo produttore - Temp. dell' aria - % Um. rel. aria Micotossina prodotta Alimenti contaminati Effetti clinici Limiti di legge - % Um. granella Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Temp C Opt. 32 C Um. rel. aria 82% Um. granella 16-30% Aflatossine B1(M1),B2, G1,G2 Mais, cereali, arachidi, semi di cotone, noci, soia, caffè, fichi, latte e derivati, uova. - Tossiche per il fegato - Riduz. crescita e produzioni - Emorragie - Cancerogene - Genotossiche - R.to 1881/06/CE del R.to 2174/03/CE del R.to 683/04/CE del 13/04/ Dir 29/1999/CE del Aspergillus ochraceus; Penicillium s.p. Temp C Opt. 28 C Um. rel. aria>80% Um. granella 16-20% Ocratossina A Mais, cereali, arachidi, caffè, cacao, uva passita, uva, frutta secca, vino, spezie, formaggio, carne di maiale conservata. - Tossiche per reni e fegato - R.to 1881/06/CE del R.to 472/02/CE del R.to 683/04/CE del R.to 123/05/CE del Fusarium graminearum; Fusarium culmorum Fusarium sporotrichioides Temp C Opt. 25 C Um. rel. aria 94% Um. gran % Deossinivalenolo (DON) Nivalenolo (NIV) Zearalenone T2 - HT-2 Mais, cereali. - Rifiuto del cibo - Vomito - Turbe riproduttive - Emorragie - Diarrea, - Crescita ridotta - R.to 1126/07/CE del R.to 1881/06/CE del R.to 856/2005/CE del Uomo: - sosp. cancro esofago -- R.to 1126/07/CE Fusarium verticillioides (moniliforme); F. proliferatum Temp C Opt. 25 C Um. rel. aria 91% Um. granella 18-20% Fumonisine Mais, cereali. Animali - crescita stentata in generale - encefalopatia del R.to 1881/06/CE del R.to 856/2005/CE del negli ecquina - edema nei suini 2

6 2. Patogenesi e micotossinogenesi La penetrazione del patogeno nell ospite è il primo atto del processo di patogenesi. I principali meccanismi utilizzati per la penetrazione sono: - penetrazione diretta attraverso le superfici integre della cuticola; - penetrazione attraverso apertura naturali come: stomi, lenticelle ecc.; - penetrazione attraverso gli organi fiorali; - penetrazioni attraverso lesioni naturali o ferite di altra natura; - penetrazione attraverso vettori come: insetti, nematodi, fanerogame parassite, funghi, ecc. La penetrazione delle superfici intatte avviene attraverso la formazione di un appressorio che si origina dalla germinazione delle spore che si trovano a stretto contatto con la superficie della pianta. Dall appressorio, che è una parte specializzata dell ifa fungina che si sviluppa dalla spora in germinazione, si forma mediante la prominenza di una nuova ifa lo stiletto di penetrazione, con il quale il patogeno avanza nello strato cuticolare. L avanzamento dello stiletto avviene attraverso un meccanismo chimico mediato dalla produzione di enzimi e un meccanismo fisico prodotto grazie all elevata pressione osmotica che si crea nel micelio. Il grado di polimerizzazione, l abbondanza di pectina e cellulosa nello strato cuticolare, oltre che, l assorbimento di acqua, quindi il turgore cellulare sono fattori che influenzano questo tipo di penetrazione. I funghi patogeni che penetrano attraverso gli stomi allungano, dopo la germinazione delle spore, l ifa nella direzione della camera stomatica. Di rado si danno casi in cui il micelio forza l apertura dello stoma se chiusa o semichiusa. Nel mais gli stomi hanno una larghezza di 5 e una lunghezza di 25 con foro ellittico di 90 q di area. Una pianta di mais possiede circa 200 milioni di stomi, che con l area adiacente fanno, quando aperti, l 1,5% della superficie. Piante giovani presentano aperture stomatiche più piccole delle piante adulte sfavorendo perciò questo tipo di penetrazione che è invece favorita da T elevate che aumentano l apertura degli stomi. Gli stili e gli stimmi hanno strutture di tipo ghiandolare escretivo, i tessuti sono molto ricchi di spazi intercellulari e di cellule con pareti sottili. In alcune piante gli stili sono provvisti di veri e propri canali, in altre no. Il patogeno, attraverso un azione litica o mediante la forzatura e lo schiacciamento delle cellule, penetra nella pianta percorrendo gli spazi intercellulari o i canali, come fa il tubo pollinico. I patogeni che penetrano nell ospite utilizzando le lesioni provocate nella cuticola da agenti biotici e abiotici, sono comunemente definiti patogeni da ferita. Diverse muffe utilizzano questo meccanismo di penetrazione che è favorito dai numerosi fattori che possono provocare le ferite attraverso le quali essi penetrano. Una delle principali cause biotiche è costituita dall attacco degli insetti che si nutrono dei tessuti della pianta, in particolar modo da quelli che allo stadio larvale 3

7 colpiscono la spiga, come Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella ecc. Tra le principali cause abiotiche sono da annoverare fattori meteorici come il vento e la grandine e i danni meccanici provocati durante il raccolto. L utilizzo di pratiche agricole e colturali scorrette, come ad esempio la cattiva taratura delle mietitrebbiatrici, possono favorire questo meccanismo di infezione. Il trasporto dei patogeni con l aiuto di insetti o di altri animali può essere considerato come trasporto passivo delle spore o come inoculo diretto del patogeno negli organi dell ospite. Questo tipo di penetrazione richiede spesso meccanismi di interazione molto specifici ed è quindi utilizzato da quei patogeni che si sono evoluti adattando il proprio ciclo vitale al comportamento degli organismi con i quali interagiscono. Diverse specie fungine, ad esempio, utilizzano gli insetti impollinatori come le api e attraverso lo stilo giungono ad infettare il seme. Superata o aggirata la cuticola i patogeni si diffondono attraverso gli spazi intercellulari nei tessuti sottoepidermici contraendo con le cellule rapporti di diverso tipo che possono portare alla morte cellulare come nel caso delle malattie necrotiche, alla modificazione del metabolismo o a diversi rapporti di parassitismo. Una volta compiuto il proprio ciclo vitale, i patogeni svernano nel terreno o all interno dei residui colturali attraverso il micelio, le spore o altri organi di resistenza specifici, nella forma anamorfa (riproduzione assessuata) e in alcuni casi in quella teleomorfa (riproduzione sessuata). Diversi sono i fattori, intrinseci (compositivi) ed estrinseci (ambientali), che influenzano la germinazione e la velocità di crescita delle muffe. La quasi totalità delle muffe è mesofila, ovvero germina e cresce entro un intervallo di temperatura moderato, tra + 10 e + 40 C, con un ottimo tra 25 e 30 C e rari casi di crescita termofilica (oltre + 50 C) o psicrotrofica (al di sotto di + 8 C). Le temperature ottimali di crescita possono essere perciò estremamente diverse e caratteristiche di ogni singolo specie fungina. Ad esempio, quelle del Penicillium sono significativamente più basse di quelle di Aspergillus, pertanto nei climi temperati è favorita la crescita dei primi a scapito dei secondi, mentre l inverso si verifica nei climi sub-tropicali e tropicali a temperature superiori od uguali a + 30 C (Tab. 2). L umidità ambientale o meglio ancora la disponibilità di acqua libera condizionano in modo determinante lo sviluppo del micelio fungino. In generale, l umidità relativa dell ambiente che permette la crescita delle diverse specie varia dal 70 al 95 %, mentre, il medesimo effetto, si riscontra in relazione all umidità relativa del prodotto per valori superiori al 17 % nel caso ad esempio di Aspergillus flavus. Considerando tuttavia che in una matrice complessa qual è il substrato alimentare, non è tanto la bruta presenza di acqua ad influenzare crescita e metabolismo dei miceti quanto piuttosto la disponibilità di acqua libera, si preferisce collegare la capacità di crescere al valore di attività dell acqua (a w ). Un valore a w inferiore a 0,930 favorisce in uguale misura la colonizzazione del prodotto ad opera di batteri Gram positivi (in particolare micrococchi, enterococchi, e stafilococchi) e di miceti (muffe e lieviti), mentre a valori inferiori a 0,860 la crescita è riservata esclusivamente a lieviti e muffe, cessando del tutto solo quando il 4

8 valore scende al di sotto di 0,600. La diminuzione dell attività dell acqua e la progressiva disidratazione del prodotto, limita la velocità e la possibilità di crescita delle muffe. L acidità del substrato non influenza significativamente la crescita delle muffe, il cui intervallo di ph ottimale varia tra 3 e 6,5 con possibilità di svilupparsi anche al di fuori di tale intervallo. La maggior parte delle muffe sono aerobi stretti (obbligati), ovvero necessitano di almeno una piccola presenza di ossigeno per il proprio metabolismo. Una caratteristica delle ife fungine e la cosiddetta crescita apicale, nel senso che l avanzamento dell ifa è dovuta alla crescita delle sue cellule periferiche mentre quelle che le precedono tendono ad invecchiare. Nelle cellule che invecchiano il metabolismo diverge dalla condizione normale (metabolismo primario, con produzione di energia e composti essenziali per la crescita) a quella del metabolismo secondario, per la produzione di composti che non svolgono una funzione vitale per la cellula. Tra questi ultimi sono presenti sostanze utili all uomo, come ad esempio gli antibiotici ed altre tossiche, come le micotossine. Le condizioni di temperatura e umidità ideali per il processo di micotossinogenesi si verificano in un intervallo molto più ristretto rispetto a quello ideale di crescita. II tipo di substrato è invece l'elemento che probabilmente più di ogni altro influenza la produzione di tossine. I vegetali ricchi in amido e poveri in proteine presentano uno squilibrio tra componenti azotati e componenti carboniosi, con una prevalenza di questi ultimi. Tale squilibrio rende possibile l avvio dello specifico processo biosintetico negli alimenti di origine vegetale ma lo ostacola nei prodotti di origine animale. La presenza di micotossine in questi ultimi, in genere, è la conseguenza dell ingestione da parte degli animale di alimenti (mangimi) già contaminati, che provocano l accumulo dei tossici in alcuni organi bersaglio (ad esempio il rene) o, previa eventuale biotrasformazione nel fegato o in altri organi dell animale, l escrezione nel latte e nell uovo. Tab. 2: Condizioni di crescita e micotossinogenesi per alcune muffe. specie: Aspergillus flavus MINIMA OTTIMALE MASSIMA (substrato con a w = 0,95) temperatura per la crescita 10 C 25 C 50 C temperatura per la aflatossinogenesi 16 C 27 C 40 C specie: Penicillium viridicatum (substrato con a w = 0,95) temperatura per la crescita 0 C 21 C 30 C temperatura per la ocratossinogenesi 12 C 20 C 24 C 5

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10 risulta sia epatotossica che nefrotossica. La fumonisina B 1 agisce principalmente a livello polmonare, mentre l ocratossina agisce a livello renale e lo zearalenone esercita di preferenza i propri effetti sull apparato riproduttore (si vedano le tabelle 3 e 4). Tab. 3: valori di PMTDI (Provisional Maximum Tolerable Daily Intake) per le principali micotossine e loro classificazione in base all effetto cancerogeno. EFFETTO CANCEROGENO DELLE MICOTOSSINE SULL UOMO Micotossina Uomo Animali Classificazione* PARAMETRI TOSSICOLOGICI Tolerable Daily Intake (TDI) (defininitivo/provvisorio) Aflatossine (miscela naturale e B1) Aflatossina M1 Evidenze sufficienti Evidenze insufficienti Evidenze sufficienti Evidenze sufficienti Cancerogeno Possibilmente cancerogeno ALARA (As Low As Reasonably Achievable) Fumonisine Zearalenone Deossinivalenolo Evidenze insufficienti Evidenze sufficienti Evidenze insufficienti Possibilmente cancerogeno 2ug/Kg pc/giorno** 0,2 ug/kg pc/giorno** 1ug/kg pc/ giorno** Tossina T-2 0,06 ug/kg pc/giorno** Tossina HT-2 0,06 ug/kg pc/giorno** Nivalenolo Ocratossina Patulina Evidenze insufficienti Assenza sufficiente evidenza Evidenze sufficienti Evidenze insufficienti Possibilmente cancerogeno Non classificabile come cancerogeno 0,7 ug/kg pc/giorno** 0,005 ug/kg pc/giorno*** 0.4 ug/kg pc/giorno**** *IARC Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro ** Final SCOOP Task , 2003 *** Final SCOOP Task 3.2.7, 2002 **** Final SCOOP Task 3.2.8,

11 Tab. 4: Dosi di micotossine ed effetti in diverse specie e categorie di animali. CATEGORIA ANIMALE DOSE (mg/kg o ppm) EFFETTO Fonte: autori vari. AFLATOSSINE Bovini Vitelli 0,15 Riduzione della crescita e dell efficienza alimentare Vitelloni 1,00 Danni al fegato e perdita di peso 2,00 Gravi danni epatici, morte Vacche da latte 1,50 Riduzione della produzione di latte Suini 0,20 Crescita ridotta Avicoli 0,40 Gravi danni epatici, immunodepressione DEOSSINIVALENOLO Bovini 12,00 X 10 sett. Nessuno Suini Ingrasso 5,00 8,00 Riduzione sostanziale dell ingestione (anche 50%) 12,00 Rifiuto completo dell alimento 20,00 Comparsa del vomito Scrofe 5,00 Riduzione del peso dei feti ZEARALENONE Bovini Manze 12,00 Ridotta fertilità Vacche 50,00 Ridotta fertilità Suini Scrofe 3,00 10,00 Anestro e false gravidanze Scrofe gravide 12,00 Morte embrionale meno suinetti nati per parto Avicoli Polli e tacchini da carne 200,00 Nessun effetto FUMONISINE Bovini 100,00 Lievi danni al fegato e leggera riduzione dell incremento di peso 200,00 Lievi danni al fegato, considerevole riduzione dell ingestione e dell accrescimento Suini 25,00 Lievi danni epatici e riduzione dell efficienza di utilizzazione della razione 100,00 Forte edema polmonare e morte Avicoli Tacchini 100,00 Ridotta ingestione, danni al fegato, rachitismo, diarrea e lesioni alle tibie Polli 200,00 Ridotta ingestione, danni al fegato, rachitismo, diarrea e lesioni alle tibie Equini 10,00 Danni al fegato, leucoencefalite e morte 8

12 Aflatossina B1 Fumonisina B1 Ocratossina A Patulina Zearalenone Tossina T-2 (tricotecene) Deossinivalenolo (tricotecene) Nivalenolo (tricotecene) Citrinina Fig. 1: struttura chimica di alcune micotossine (da: Bennett et al. 2003). 9

13 4. Limiti di legge per le micotossine nei prodotti alimentari Allo stato attuale la legislazione nazionale e comunitaria ha previsto la regolamentazione solo di determinati gruppi di micotossine in relazione a specifiche tipologie di prodotti (Tab. 5-6), mentre, per altri, la legge non ha ancora stabilito dei limiti precisi. Il gruppo di lavoro sulle sostanze contaminanti della Commissione Europea (CE), alla luce dei nuovi dati sull analisi del rischio fornita dal gruppo operativo di comunicazione scientifica della CE (Final SCOOP Task , 2003) ha da poco definito i livelli massimi permessi di deossinivalenolo, zearalenone e fumonisine, mentre sono in fase di discussione quelli relativi alla tossina T2 e HT2. Tab. 5: tenori massimi di micotossine ammessi nei prodotti alimentari. Prodotti alimentari Aflatossine Arachidi da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell'impiego come ingredienti di prodotti alimentari. Frutta a guscio da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell'impiego quale ingrediente di prodotti alimentari. Arachidi, frutta a guscio e relativi prodotti di trasformazione, destinati al consumo umano diretto o all'impiego quali ingredienti di prodotti alimentari. Frutta secca da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell'impiego quale ingrediente di prodotti alimentari. Frutta secca e relativi prodotti di trasformazione, destinati al consumo umano diretto o all'impiego quali ingredienti di prodotti alimentari. Tutti i cereali e loro prodotti derivati, compresi i prodotti tra-sformati a base di cereali, eccetto i prodotti alimentari di cui ai punti 2,1,7, 2,1,10 e 2,1,12. Granturco da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell'impiego quale ingrediente di prodotti alimentari. Latte crudo (6), latte trattato termicamente e latte destinato alla fabbricazione di prodotti a base di latte. Le seguenti specie di spezie: Capsicum spp. (frutti secchi dello stesso, interi o macinati, compresi peperoncini rossi, peperoncino rosso in polvere, pepe di Caienna e paprica), Piper spp. (frutti dello stesso, compreso il pepe bianco e nero), Myristica fragrans (noce moscata), Zingiber officinale (zenzero), Curcuma longa (curcuma). Alimenti a base di cereali e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini (3)(7). Tenori massimi ( g/kg) Somma di B1, B2, B1 M1 G1 e G2 8,0 (5) 15,0 (5) 5,0 (5) 10,0 (5) 2,0 (5) 4,0 (5) 5,0 10,0 2,0 4,0 2,0 4,0 5,0 10,0 5,0 10,0 0,1 0,050 10

14 Alimenti per lattanti e alimenti di proseguimento, compresi il latte per lattanti e il latte di proseguimento 0,025 (4)(8). Alimenti dietetici a fini medici speciali (9)(10), destinati specifi-catamente ai lattanti. 0,1 0,025 Ocratossina A Cereali non trasformati 5,0 Tutti i prodotti derivati dai cereali non trasformati, compresi i prodotti trasformati a base di cereali e i cereali destinati al consumo umano diretto, eccetto i prodotti 3,0 alimentari di cui ai punti 2,2,9 e 2,2,10. Uve secche (uve di Corinto, uva passa, uva sultanina) 10,0 Caffè torrefatto in grani e caffè torrefatto macinato, escluso il caffè solubile. 5,0 Caffè solubile (istantaneo). 10,0 Vini (compreso il vino spumante ed esclusi i vini liquorosi e i vini con un titolo alcolometrico non inferiore 2,0 (12) al 15 % vol) e vini di frutta (11). Vini aromatizzati, bevande aromatizzate a base di vino e cock-tail aromatizzati di prodotti vitivinicoli (13). 2,0 (12) Succo d'uva, succo d'uva concentrato ricostituito, nettare d'uva, mosto d'uva e mosto d'uva concentrato ricostituito, 2,0 (12) destinati al consumo umano diretto (14). Alimenti a base di cereali e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini (3)(7). 0,50 Alimenti dietetici a fini medici speciali (9)(10) destinati specifi-camente ai lattanti. 0,50 Caffè crudo, frutta secca diversa dalle uve secche, birra, cacao e prodotti a base di cacao, vini liquorosi, prodotti a base di carne, spezie e liquirizia Patulina Succhi di frutta, succhi di frutta concentrati ricostituiti e nettari di frutta (14). 50 Bevande spiritose (15), sidro e altre bevande fermentate derivate dalle mele o contenenti succo di mela. 50 Prodotti contenenti mele allo stato solido, compresi la composta di mele e il passato di mele, destinati al consumo diretto, eccetto i prodotti alimentari di cui ai 25 punti 2,3,4 e 2,3,5. Succo di mela e prodotti contenenti mele allo stato solido, compresi la composta e il passato di mele, per lattanti e bam-bini (16), etichettati e venduti come tali 10,0 (4). Alimenti destinati ai lattanti e ai bambini diversi dagli alimenti a base di cereali (3)(4). 10,0 Deossinivalenolo (17). Cereali non trasformati (18)(19) diversi da grano duro, avena e granoturco Grano duro e avena non trasformati (18)(19) Granoturco non trasformato (18), ad eccezione del (20) 11

15 granoturco non trasformato destinato alla molitura ad umido (*). Cereali destinati al consumo umano diretto, farina di cereali, crusca e germe come prodotto finito 750 commercializzato per il consumo umano diretto, eccetto i prodotti alimentari di cui ai punti 2,4,7, 2,4,8 e 2,4,9. Pasta (secca) (22). 750 Pane (compresi piccoli prodotti da forno), prodotti della pasticceria, biscotteria, merende a base di cereali e 500 cereali da colazione. Alimenti a base di cereali trasformati e altri alimenti 200 destinati ai lattanti e ai bambini(3)(7). Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC o e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati 750 (20) al consumo umano diretto di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni 500 micron di cui al codice NC e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati al consumo (20) umano diretto di dimensioni 500 micron di cui al codice NC Zearalenone (17). Cereali non trasformati (18)(19) diversi dal granoturco. 100 Granoturco non trasformato (18) ad eccezione del granoturco non trasformato destinato alla molitura ad 350 (20) umido (*). Cereali destinati al consumo umano diretto, farina di cereali, crusca e germe come prodotto finito commercializzato per il consumo umano diretto, eccetto i 75 prodotti alimentari di cui ai punti 2,5,6, 2,5,7, 2,5,8, 2,5,9 e 2,5,10. Olio di granoturco raffinato. 400 (20) Pane (compresi piccoli prodotti da forno), prodotti della pasticceria, biscotteria, merende a base di cereali e cereali da colazione, esclusi le merende a base di granoturco e i cereali da colazione a base di granoturco. Granoturco destinato al consumo umano diretto, merende a base di granoturco e cereali da colazione a base di granoturco. Alimenti a base di cereali trasformati (esclusi quelli a base di granoturco) e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini (3)(7). Alimenti a base di granoturco trasformato destinati ai lattanti e ai bambini (3)(7). Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC o e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati al consumo umano diretto di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC (20) (20) 200 (20) 12

16 Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni 500 micron di cui al codice NC e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati al consumo 300 (20) umano diretto di dimensioni 500 micron di cui al codice NC Fumonisine Somma di B1 e B2 Granoturco non trasformato (18), ad eccezione del granoturco non trasformato destinato alla molitura ad (23) umido (*). Granoturco destinato al consumo umano diretto, prodotti a base di granoturco destinati al consumo umano diretto, (23) ad eccezione degli alimenti elencati ai punti 2,6,3 e 2,6,4. Cereali da colazione e merende a base di granoturco. 800 (23) Alimenti a base di granoturco trasformato e altri alimenti 200 (23) destinati ai lattanti e ai bambini (3)(7). Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC o e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati (23) al consumo umano diretto di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni 500 micron di cui al codice NC e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati al consumo (23) umano diretto di dimensioni 500 micron di cui al codice NC Tossine T-2 e HT-2 (17) Somma delle tossine T-2 e HT-2 Cereali non trasformati (18) e prodotti a base di cereali. (*) L'esenzione si applica unicamente al granoturco per il quale è chiaro, attraverso ad esempio l'etichettatura e la destinazione, che è destinato unicamente alla molitura ad umido (produzione di amido). (1) Per gli ortaggi, la frutta e i cereali, si rimanda ai prodotti alimentari elencati nelle categorie di appartenenza secondo le definizioni di cui al regolamento (CE) n. 396/2005 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 23 febbraio 2005, concernente i livelli massimi di residui di antiparassitari nei o sui prodotti alimentari e mangimi di origine vegetale e animale e che modifica la direttiva 91/414/CEE del Consiglio (GU L 70 del , pag. 1), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 178/2006 (GU L 29 del , pag. 3). Ciò significa tra l'altro che il grano saraceno (Fagopyrum spp.) è compreso tra i «cereali» e i prodotti a base di grano saraceno sono compresi tra i «prodotti a base di cereali». (2) I tenori massimi non si applicano agli spinaci freschi destinati alla trasformazione e che vengono direttamente trasportati in blocco dal campo allo stabilimento di trasformazione. (3) Per i prodotti alimentari indicati in questa categoria, si rimanda alla definizione di cui alla direttiva 96/5/CE della Commissione, del 16 febbraio 1996, sugli alimenti a base di cereali e gli altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini (GU L 49 del , pag. 17), modificata da ultimo dalla direttiva 2003/13/CE (GU L 41 del , pag. 33). (4) I tenori massimi si riferiscono ai prodotti pronti per l'uso (commercializzati come tali o ricostituiti secondo le istruzioni del fabbricante). (5) I tenori massimi si riferiscono alla parte commestibile delle arachidi e della frutta a guscio. Se le arachidi e i frutti a guscio vengono analizzati interi, nel calcolo del tenore delle aflatossine si suppone che tutta la contaminazione sia nella parte commestibile. (6) Per i prodotti alimentari indicati in questa categoria si rimanda alla definizione di cui al regolamento (CE) n. 853/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004, che stabilisce norme specifiche in materia di igiene per gli alimenti di origine animale (GU L 226 del , pag. 22). (7) I tenori massimi si riferiscono alla materia secca, che è definita conformemente al regolamento (CE) n. 401/2006. (8) Per i prodotti alimentari indicati in questa categoria, si rimanda alla definizione di cui alla direttiva 91/321/CEE della Commissione, del 14 maggio 1991, sugli alimenti per lattanti e alimenti di proseguimento (GU L 175 del , pag. 35), modificata da ultimo dalla direttiva 2003/14/CE (GU L 41 del , pag. 37). 13

17 (9) Per i prodotti alimentari elencati in questa categoria, si rimanda alla definizione di cui alla direttiva 1999/21/CE della Commissione, del 25 marzo 1999, sugli alimenti dietetici destinati a fini medici speciali (GU L 91 del , pag. 29). (10) I tenori massimi si riferiscono, nel caso del latte e dei prodotti lattiero-caseari, ai prodotti pronti per il consumo (commercializzati come tali o ricostituiti secondo le istruzioni del produttore), mentre nel caso dei prodotti diversi dal latte e dai prodotti lattiero-caseari si riferiscono alla materia secca. La materia secca è definita conformemente al regolamento (CE) n. 401/2006. (11) Per i prodotti alimentari indicati in questa categoria, si rimanda alla definizione di cui al regolamento (CE) n. 1493/1999 del Consiglio, del 17 maggio 1999, relativo all'organizzazione comune del mercato vitivinicolo (GU L 179 del , pag. 1), modificato da ultimo dal protocollo relativo alle condizioni e modalità d'ammissione della Repubblica di Bulgaria e della Romania all'unione europea (GU L 157 del , pag. 29). (12) Il tenore massimo si applica ai prodotti a partire dal raccolto del (13) Per i prodotti alimentari indicati in questa categoria, si rimanda alla definizione di cui al regolamento (CEE) n. 1601/91 del Consiglio, del 10 giugno 1991, che stabilisce le regole generali relative alla definizione, alla designazione e alla presentazione dei vini aromatizzati, delle bevande aromatizzate a base di vino e dei cocktail aromatizzati di prodotti vitivinicoli (GU L 149 del , pag. 1), modificato da ultimo dal protocollo relativo alle condizioni e modalità d'ammissione della Repubblica di Bulgaria e della Romania all'unione europea. Il tenore massimo di OTA applicabile a tali bevande è determinato in funzione della proporzione di vino e/o mosto d'uva presente nel prodotto finito. (14) Per i prodotti alimentari indicati in questa categoria, si rimanda alla definizione di cui alla direttiva 2001/112/CE del Consiglio, del 20 dicembre 2001, concernente i succhi di frutta e altri prodotti analoghi destinati all'alimentazione umana (GU L 10 del , pag. 58). (15) Per i prodotti alimentari indicati in questa categoria, si rimanda alla definizione di cui al regolamento (CEE) n. 1576/89 del Consiglio, del 29 maggio 1989, che stabilisce le regole generali relative alla definizione, alla designazione e alla presentazione delle bevande spiritose (GU L 160 del , pag. 1), modificato da ultimo dal protocollo relativo alle condizioni e modalità d'ammissione della Repubblica di Bulgaria e della Romania all'unione europea. (16) Lattanti e bambini, così come definiti dalla direttiva 91/321/CEE e dalla direttiva 96/5/CE. (17) Ai fini dell'applicazione dei tenori massimi di deossinivalenolo, zearalenone, delle tossinet-2 e HT-2 di cui ai punti 2.4, 2.5 e 2.7, il riso non è incluso nella voce «cereali» e i prodotti a base di riso non sono inclusi nei «prodotti a base di cereali». (18) Il tenore massimo è applicabile ai cereali non trasformati commercializzati per la prima trasformazione. Con «prima trasformazione» s'intendono tutti i trattamenti fisici o termici della granella, diversi dall'essiccazione. Se non viene esercitata alcuna azione fisica sulla cariosside e quest'ultimo rimane intatto dopo la pulizia e la cernita, le procedure di pulizia, cernita o essiccazione non sono considerate parte della «prima trasformazione». Nei sistemi di produzione e trasformazione integrati, il tenore massimo si applica ai cereali non trasformati ove essi siano destinati alla prima trasformazione. (19) Il tenore massimo è applicabile ai cereali raccolti e presi in consegna a decorrere dalla campagna di commercializzazione 2005/2006, conformemente al regolamento (CE) n. 824/2000 della Commissione, del 19 aprile 2000, che stabilisce le procedure di presa in consegna dei cereali da parte degli organismi d'intervento nonché i metodi di analisi per la determinazione della qualità (GU L 100 del , pag. 31), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 1068/2005 (GU L 174 del , pag. 65). (20) Il tenore massimo si applica dal 1o luglio (21) Questa categoria include anche prodotti simili con denominazioni diverse, come ad esempio il semolino. (22) Con il termine pasta (secca) si intende la pasta con un contenuto di acqua di circa il 12 %. (23) Il tenore massimo si applica dal 1 ottobre

18 5. Le prospettive della ricerca Il problema delle micotossine nelle derrate agricole alimentari è molto complesso e coinvolge tutte le fasi della filiera alimentare. La prevenzione del rischio deve perciò essere effettuata attraverso un approccio integrato atto alla messa in pratica delle buone pratiche agricole e produttive attualmente disponibili e finalizzate a minimizzare i rischi di contaminazione. Comunque, tra le diverse fasi della filiera alimentare, quella di campo, è una delle più suscettibili all attacco fungino da cui può conseguirne l avvio del processo di micotossinogenesi. Le principali linee di ricerca, sono perciò orientate all ingegnerizzazione di piante con geni per la resistenza agli insetti, ai funghi patogeni e in grado di detossificare le micotossine. Le ferite inferte dagli insetti rappresentano una delle principali cause d inoculo dei patogeni fungini, soprattutto quando è presente una forte correlazione tra l infestazione degli insetti patogeni che causano le lesioni e l infezione delle specie fungine produttrici di micotossine. Tra le sostanze che esercitano un azione tossica sugli insetti e che sono oggetto della ricerca volta alla produzione di piante transgeniche, si annoverano gli inibitori delle proteasi (Vogel et al., 1968), presenti naturalmente in molte specie vegetali, soprattutto nei semi come sostanze di resistenza naturale (Richardson, 1991). Espressi in pianta, questi inibitori hanno evidenziato un incremento della resistenza delle piante transgeniche rispetto ai controlli (Johnson, 1989). Un altro approccio è far esprimere nei vegetali sostanze specifiche isolate da insetti parassiti di altri insetti, che hanno un'azione di alterazione del normale metabolismo degli entomofagi: è questo il caso di alcuni ormoni costituiti da piccoli peptidi che non hanno analoghi nel mondo vegetale. La possibilità di esprimere in pianta piccoli peptidi ad azione neurotossica per alcuni insetti è stata già testata (Rao et al., 1996). Inoltre, la ricerca in questo settore ha consentito di isolare diversi geni codificanti proteine con attività insetticida derivanti dal Bacillus thuringiensis (Bt). Il Bacillus thuringiensis è un batterio gram-positivo del suolo che durante la fase stazionaria del suo ciclo vitale forma una paraspora cristallina, da cui il nome Cry, con attività tossica verso diverse specie (Griffitts et al., 2005). Ad oggi sono state identificate numerose sequenze geniche per la produzione di proteine cristalline, tossiche verso specie di insetti appartenenti a ordini diversi, tra cui: lepidotteri, coleotteri, ortotteri, omotteri, mallofagi e imenotteri ( Schnepf et al. 1998). Attraverso l ingegneria genetica, i geni che codificano la proteina insetticida, isolati dal batterio, sono stati modificati ed inseriti nel corredo genetico di diverse specie agrarie. Grazie a questa modificazione le piante Bt sono in grado di esprimere la tossina in una forma direttamente attiva, che non necessita una biotrasformazione per esplicare il proprio effetto tossico verso gli organismi che possiedono i recettori specifici della tossina. In natura, infatti, la proteina espressa dai geni cry è una pretossina che per svolgere la propria attività tossica, necessita di essere attivata dagli enzimi digestivi degli 15

19 insetti che se ne nutrono. Una volta ingerita, la proteina Cry si lega al rivestimento intestinale degli insetti, provocando la formazione di canali ionici che alterano il normale funzionamento cellulare. Entro due ore dall ingestione dei tessuti delle piante Bt gli insetti smettono di nutrirsi e nell arco di due/tre giorni muoiono. Le linee di ricerca per la resistenza ai funghi patogeni non hanno ottenuto fino ad ora lo stesso successo di quelle per la resistenza agli insetti. Le cause di quest insuccesso sono in parte dovute alla scarsa conoscenza delle interazioni esistenti tra patogeni fungini e pianta e, al fatto che la resistenza delle piante ai funghi patogeni è spesso regolata da meccanismi poligenici. L isolamento di tali geni e la trasformazione delle piante, perciò, risultano processi più complessi rispetto a quelli che prevedono il coinvolgimento di uno o pochi geni. In questo settore le linee di ricerca che si trovano ad uno stadio avanzato comprendono: - lo studio di proteine con attività antifungina contenute nelle cariossidi di mais (Chen, 1999; Guo, 1998; Bass, 1995); - lo studio del gene chit42 isolato dal fungo Trichoderma harzianum (Filippone et al., 1996) che determina la sintesi di un endochitinasi che demolisce le pareti cellulari dei miceti; - lo studio del gene codificante per l'osmotina, una proteina PR della classe 5, la cui attività antifungina si esplica attraverso l alterazioni della membrana plasmatica e dell equilibrio osmotico della cellula fungina (Liu et al., 1994; Veronese et al., 1998). Un'altra strategia di ricerca è quella volta alla modificazione delle vie per la biosintesi di metaboliti secondari con attività antimicotica o l introduzione di nuovi metaboliti quando siano presenti nella specie ricevente precursori comuni. Nel primo caso la ricerca sta lavorando su diversi metaboliti secondari del mais coinvolti nella resistenza verso diverse specie di Aspergillus e Gibberella. Tra questi si trovano acidi idrossamici come il 4-acetyl-benzoxazolin-2-one (4-ABOA) e la diferuloylputrescina (Miller, 1996), composti fenolici come l (E)-acido ferulico (Assabgui, 1993) e prodotti volatili (Zeringue, 1996). Nel secondo caso la ricerca sta studiando la possibilità di introdurre nei cereali nuove vie biosintetiche, come ad esempio quella per la sintesi degli stilbeni, sostanze polifenoliche ad azione antifungina, identificate in diverse specie del regno vegetale appartenenti alle famiglie delle Fabaceae, Vitaceae, Pinaceae, Mirtaceae, Fagaceae, Liliaceae, Moraceae e Papilionaceae. La maggior parte delle micotossine vengono prodotte sotto specifiche condizioni colturali, ed inoltre, diverse evidenze scientifiche dimostrano che i segnali prodotti dalla pianta ospite possono svolgere un ruolo sia positivo che negativo sull accumulo di micotossine (Norton, 1999; Burow, 1997). Per questo le strategie per detossificare le micotossine riguardano la modificazione delle vie 16

20 metaboliche che conducono al loro accumulo nella pianta o la detossificazione delle stesse in planta. Nel primo caso la ricerca è incentrata sull ingegnerizzazione di piante in grado di spegnere sia le vie biosintetiche che consentono ai miceti la produzione di micotossine che quelle atte alla produzione dei segnali della pianta che promuovono la sintesi e l accumulo delle tossine. La seconda strategia prevede la trasformazione di piante per la produzione di enzimi catabolici capaci di detossificare le micotossine in situ, prima che possano accumularsi nella pianta. Geni codificanti enzimi detossificanti, provenienti da specie appartenenti a regni diversi, sono già stati isolati ed inseriti con successo in piante d interesse agrario (Karlovsky, 1999). 17

21 6. I prodotti in commercio La coltivazione di piante geneticamente modificate nel 2006 ha coinvolto una superficie di circa 102 milioni di ettari (James C., 2006) concentrati in cinque stati: Stati Uniti con 56,4 milioni di ettari, Argentina con 18,0 milioni di ettari, Brasile con 11,5 milioni di ettari, Canada con 6,1 milioni di ettari, India con 3,8 milioni di ettari e Cina con 3,5 milioni di ettari. Come riportato nella tabella 6, la coltivazione ha riguardato quasi esclusivamente quattro colture: soia, mais, cotone e colza geneticamente modificate per renderle resistenti agli insetti, tolleranti agli erbicidi glifosato e glufosinato o per entrambe le caratteristiche. Di queste quattro colture solo mais e cotone presentano geni per la resistenza ad alcune specie parassite di Lepidotteri e Coleotteri, come: piralide (Ostrinia nubilalis), sesamia (Sesamia nonagrioides), diabrotica (Diabrotica virgifera virgifera) ed Helicoverpa zea nel caso del mais e, verme rosa del cotone (Pectinophora gossypiella), eliotide del tabacco (Heliothis virescens) nel caso del cotone. Ad oggi non esistono in commercio piante geneticamente modificate resistenti ai funghi patogeni o in grado di detossificare le micotossine. Inoltre, la resistenza agli insetti nelle piante GM d interesse agrario è limitata ad alcune specie patogene di solo due colture da pieno campo, di cui solo il mais presenta un largo impiego nel settore alimentare, specialmente come prodotto destinato all alimentazione animale. Quindi, nonostante l ingegneria genetica delle piante abbia aperto interessanti prospettive di ricerca nel campo della lotta alle micotossine, fino ad ora, gli strumenti messi a disposizione per ridurre il rischio da micotossine nella filiera agroalimentare sono limitati e rivolti ai soli presunti effetti del mais Bt sul contenuto di fumonisine nella granella. Tab. 6: Principali colture GM nel mondo, 2005 Milioni di ettari % totale transgenico Soia tollerante agli erbicidi 54,4 60 Mais Bt 11,3 13 Mais Bt e tollerante agli erbicidi 6,5 7 Cotone Bt 4,9 5 Colza tollerante agli erbicidi 4,6 5 Cotone Bt e tollerante agli erbicidi 3,6 4 Mais tollerante agli erbicidi 3,4 4 Cotone tollerante agli erbicidi 1,3 2 Totale % Fonte: James C.,

22 Tab. 7: eventi di mais resistenti agli insetti autorizzati per la coltivazione a livello mondiale. Evento Notificante Geni presenti nell'inserto 176 Ciba-Geigy BT11 Syngenta Seeds, Inc. cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. bar (phosphinothricin N-acetyltransferase) di S. hygroscopicus. bla (betalactamase) cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. bar (phosphinothricin N-acetyltransferase) di S. hygroscopicus. Autorizzazione alla coltivazioni Paese Anno Argentina 1996 Canada 1996 Giappone 1996 Stati Uniti 1995 Unione europea 1997 Argentina 2001 Canada 1996 Giappone 1996 Stati Uniti 1996 CBH-351 Aventis CropScience cry9c di Bacillus thuringiensis subsp tolworthi. bar (phosphinothricin acetyltransferase) di Streptomyces hygroscopicus. bla (beta-lactamase). Stati Uniti 1998 DBT418 Dekalb Genetics Corporation cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. bar (phosphinothricin N-acetyltransferase) di S. hygroscopicus. bla (beta-lactamase). pin II (inibitore di proteasi) Argentina 1998 Canada 1997 Giappone 1999 Stati Uniti 1997 MON80100 Monsanto Company cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. EPSPS (bar 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) di Agrobacterium tumefaciens CP4. Stati Uniti 1995 cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Canada 1997 MON802 Monsanto Company EPSPS (bar 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) di Giappone 1997 Agrobacterium tumefaciens CP4. Stati Uniti 1997 MON809 cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Canada 1996 Pioneer Hi-Bred EPSPS (bar 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) di Giappone 1997 International Inc. Agrobacterium tumefaciens CP4. Stati Uniti 1997 Argentina 1998 Canada 1997 MON810 Monsanto Company cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Giappone 1996 Stati Uniti 1997 Sud Africa 1997 Unione europea 1998 Canada 2003 MON863 Monsanto Company cry3bb1di Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis Giappone No Stati Uniti 2003 TC1507 Canada 2002 Mycogen; Pioneer cry1fa2 di Bacillus thuringiensis var. aizawai. Giappone 2002 (Dupont) pat (phosphinothricin N-acetyltransferase) di S. viridochromogenes. Stati Uniti 2001 Argentina 1999 MON 863 X MON 810 MON810 x NK603 Monsanto Company Monsanto Company DAS DOW AgroSciences LLC cry3bb1di Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis. cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. cry1ab di Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. EPSPS (bar 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) di Agrobacterium tumefaciens CP4. cry1f di Bacillus thuringiensis var. aizawai. pat (phosphinothricin N- acetyltransferase) di S. viridochromogenes. Canada NR Giappone NR Stati Uniti 2000 Argentina vedi singoli eventi Australia vedi singoli eventi Canada vedi singoli eventi Giappone vedi singoli eventi Stati Uniti vedi singoli eventi Stati Uniti 2004 Fonte: Agbios ( Ht: tolleranza agli erbicidi Bt: resistenza agli insetti In seguito saranno analizzati i principali lavori condotti fino ad ora, atti a valutare i possibili effetti positivi sulla concentrazione di micotossine nella granella derivati dall utilizzo del mais Bt. L analisi vuole fare chiarezza sui risultati ottenuti, in modo da quantificare quanto l utilizzo degli ibridi Bt possa limitare il problema delle micotossine, durante le fasi del ciclo produttivo del mais. 19

23 7. Analisi dei lavori In generale, i diversi lavori hanno riguardato la costituzione di campi sperimentali: infatti, solo uno di questi (Dowd 2001) è stato condotto in campi commerciali. Negli ibridi Bt analizzati erano presenti eventi di trasformazione in cui la proteina Cry era espressa in tutti i tessuti (compreso quelli della spiga) come il MON 810, il MON 802, il Bt11 e, eventi dove la proteina Cry era espressa solo nei tessuti verdi, come il Bt 176. Tutti gli ibridi analizzati sono stati trasformati con il gene cry1ab isolato dal Bacillus thuringensis subsp. kurstaki che conferiscono alla pianta la resistenza ad alcuni Lepidotteri tra cui le larve di Ostrinia nubilalis (Piralide del mais). Le analisi effettuate hanno riguardano il confronto tra gli ibridi Bt e i corrispettivi isogenici; in particolare è stata analizzata la resistenza agli insetti infestanti, soprattutto ad Ostrinia nubilalis, la resistenza ai funghi patogeni e la concentrazione di micotossine nella granella. Nessuno degli studi analizzati ha riportato dati riguardanti la concentrazione di micotossine nella granella degli ibridi di mais tradizionali trattati contro la piralide. Come è possibile notare nella tabella 8, i diversi lavori sperimentali, se si esclude il solo lavoro condotto in campi commerciali, possono essere classificati in due gruppi: il primo comprende prove effettuate attraverso infestazione e/o infezione sia artificiale che naturale rispettivamente degli insetti (Ostrinia nubilalis) e dei funghi patogeni (Fusarium verticillioides e Aspergillus flavus). Mentre, il secondo, comprende i lavori condotti in condizioni naturali che in generale hanno anche previsto una superficie di studio più ampia (almeno 0,4 ha per ogni copia di ibridi testati). L infestazione artificiale delle larve è stata effettuata distribuendo le larve sulle foglie della pianta, in modo da simulare la prima e la seconda generazione di Ostrinia nubilalis (stadio di crescita della pianta V8-V10 e R1). L inoculo artificiale dei funghi patogeni è avvenuto con modalità differenti; negli studi dove era previsto l inoculo artificiale delle larve, questo è avvenuto utilizzando le larve come vettori, immergendole prima della loro distribuzione sulle piante in una soluzione di spore fungine (Munkvold et al., 1999). In altri casi l inoculo è avvenuto distribuendo o iniettando direttamente le spore sulla pianta (Dowd, 2000; Maupin et al., 2001; Williams et al., 2002) o distribuendo del materiale infetto tra le file degli ibridi da testare (Odvody et al., 2000). 20

24 Tab. 8: sintesi dei lavori analizzati CITAZIONE ANNO PAESE TIPO DI PROVE EVENTO INFESTAZIONE INFEZIONE Munkvold, 1999 Munkvold et al., 2000 Masoero et al., 1999 Dowd, Sperimentali MON Stati Uniti Sperimentali MON810/Bt11/ Sperimentali MON810/Bt11/176/DBT 418/CBH Stati Uniti Sperimentali MON810/Bt11/CBH351 non specificato Artificiale Artificiale Artificiale Artificiale Artificiale Artificiale Italia Sperimentali MON810 Stati Uniti Dowd, Stati Uniti Pietri et al, 2000 Maupin et al., 2001 Odvody et al., 2001 Valenta et al., Sperimentali 0,4 ha Campi convenzionali MON810/Bt11/176 Artificiale Artificiale MON810/Bt11/176 Italia Sperimentali MON Stati Uniti Sperimentali Non specificato Stati Uniti Sperimentali MON Germania sperimentali Bt11 Bakan et al., Francia/Spagna Sperimentali 0,4 ha Magg et al., Germania Sperimentali MON810/176 Williams et al., 2003 Hammond et al., 2004 Hammond et al., Stati Uniti Sperimentali MON810/Bt UFT: Stati Uniti Sperimentali 0,4 ha Stati Uniti Sperimentali MON810 Artificiale Artificiale Artificiale MON810 Artificiale Artificiale Artificiale MON810 Artificiale Condizioni artificiali Condizioni naturali Campi commerciali 21

25 8. Effetti del mais Bt sulle micotossine In base ai dati riguardanti il contenuto di micotossine nella granella degli ibridi Bt rispetto ai corrispettivi isogenici testati nei diversi lavori analizzati, è possibile individuare: - micotossine verso le quali il mais Bt non sembra avere effetti, - micotossine per le quali è presente una significativa diminuzione nel mais Bt Effetti del mais Bt su aflatossine, tricoteceni e zearalenone I risultati, in generale, non hanno evidenziato un trend significativo di diminuzione del contenuto di aflatossine, tricoteceni e zearalenone, tra gli ibridi Bt e i corrispettivi controlli isogenici. Inoltre, i valori di queste micotossine nei diversi ibridi analizzati sono risultati estremamente variabili e nella maggior parte degli studi non sono emerse variazioni statisticamente significative nel contenuto di queste micotossine tra gli ibridi transgenici e i corrispettivi isogenici. Ad esempio, per quanto riguarda il deossinivalenolo, nel lavoro condotto in Germania da Valenta et al. (2001), sono state riscontrate, in condizioni artificiali, concentrazione inferiori nei mais Bt rispetto ai corrispettivi isogenici. Al contrario, in un altro lavoro condotto sempre in Germania alle stesse condizioni da Magg et al. (2002), non sono risultate differenze nel contenuto di deossinivalenolo. Solo nel lavoro di William (2003), è stata riscontrata una concentrazione minore di aflatossine negli ibridi transgenici rispetto ai corrispettivi isogenici. Anche in questo caso, in un altro lavoro condotto da Odvody nel 2001, gli ibridi Bt presentavano una concentrazione di aflatossine maggiore degli ibridi non transgenici. L inefficacia degli ibridi Bt nel ridurre le aflatossine, i tricoteceni e lo zearalenone sembra dovuta alla scarsa correlazione esistente tra le ferite inferte dagli attacchi di piralide e l infezione dei patogeni fungini produttori di queste micotossine. Tali muffe, oltre alle ferite inferte dagli insetti, utilizzano vie di penetrazione diverse, per cui, si possono rilevare a concentrazioni elevate anche in assenza di attacchi di O. nubilalis (Magg et. al., 2002). Condizioni climatiche e ambientali favorevoli risultano perciò influenzare in modo più significativo la concentrazione delle micotossine da essi prodotte. Per esempio, l infezione da F. graminearum, principale produttore di zearalenone e tricoteceni come il deossinivalenolo, è favorita da condizioni climatiche relativamente fredde e piovose ed, utilizza come via di penetrazione preferenziale le sete fiorali del mais. Quindi, anche in assenza di danni da insetti, si possono riscontrare elevate concentrazioni delle micotossine prodotte da questi funghi. Questi fattori e l elevata fluttuazione delle popolazioni dei funghi patogeni, possono essere considerati tra le principali cause di variabilità incontrata nei diversi lavori. Gli unici lavori sopraccitati che riportano differenze nel contenuto di aflatossine, zearalenone e tricoteceni sono stati condotti inoculando le larve e/o le spore dei funghi patogeni in modo 22

26 artificiale. Questo tipo di analisi, comunque, non può essere considerata rappresentativa della reale diminuzione di micotossine ottenibile attraverso l utilizzo del mais Bt in un reale contesto colturale dove, come vedremo in seguito, numerosi fattori, sia abiotici che biotici, sono in grado di limitare tale efficienza Effetti del mais Bt sulle fumonisine I diversi lavori sperimentale condotti sia in condizioni artificiali che naturali hanno evidenziato che è presente un trend di diminuzione del contenuto di fumonisine nella granella degli ibridi transgenici rispetto a quella dei corrispettivi controlli isogenici. A titolo esemplificativo si riportano in tabella 9 i dati ottenuti nei due lavori condotti in Italia in cui, sebbene non sia note le modalità con cui tali prove siano state condotte, è stata rilevata una significativa riduzione di fumonisine nei mais transgenici rispetto ai corrispettivi isogenici. La tabella 10 riporta i limiti proposti per le fumonisine dal regolamento 1126/2007/CE del 28/09/2007. Tab. 9: concentrazione di fumonisine nella granella di mais in campi sperimentali condotti in Italia Contenuto di Fumonisine (µg/kg) Autore Anno Mais Bt Isogenico non Bt Pietri A. e Piva G Masoero et al Tab. 10: Limiti di legge per le fumonisine negli alimenti Limiti per le fumonisine previsti dal Reg. 1126/2007/CE del 28/09/2007 Prodotto Somma B1 + B2 (µg/kg) Granoturco non trasformato ad eccezione del granoturco non trasformato destinato alla molitura ad umido Granoturco destinato al consumo umano diretto, prodotti a base di granoturco destinati al consumo umano diretto, ad eccezione degli alimenti elencati ai punti 2,6,3 e 2,6, Cereali da colazione e merende a base di granoturco. 800 Alimenti a base di granoturco trasformato e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini. 200 Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC o e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati al consumo umano diretto di dimensioni > 500 micron di cui al codice NC Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni 500 micron di cui al codice NC e altri prodotti della molitura del granoturco non destinati al consumo umano diretto di dimensioni 500 micron di cui al codice NC

27 La diminuzione della concentrazione di fumonisine nella granella delle piante GM, rispetto alle corrispettive isogeniche, riscontrata dai dati ottenuti nei campi sperimentali, è dovuta alla maggior correlazione esistente tra l attacco di piralide e l infezione di F. verticillioides (moniliforme) principale produttore delle fumonisine. Infatti, le ferite inferte alla spiga di mais dalla seconda generazione delle larve di piralide, sono il sito preferenziale di inoculo del F. verticillioides, la cui infezione risulta essere favorita da condizioni climatiche caldo e umide a partire dalla fioritura fino al raccolto (condizioni ideali anche per l infestazione delle larve di piralide). Per cui, quando le ferite inferte dall attacco di O. nubilalis risultano essere il principale mezzo di inoculo, la difesa da tali insetti comporta un abbassamento della concentrazione di fumonisine nella granella. L utilizzo di ibridi tardivi e il ritardo del raccolto sono fattori che favoriscono questo tipo di interazione positiva. Comunque, sebbene i dati evidenzino un trend di diminuzione della concentrazione di fumonisine, la maggior parte dei lavori sono state condotte in condizioni artificiali, situazione che non rappresenta le reali condizioni di campo. Ad esempio, dal grafico 1 è possibile notare che le differenze tra mais Bt e isogenico sono significative in seguito ad infestazione manuale, ma non lo sono nel caso di infestazione naturale delle larve di O. nubilalis. Infatti, come emerso dall analisi, in condizioni naturali esistono altri fattori biotici e abiotici che possono favorire l infezione fungina e contro i quali il mais Bt non ha particolare effetto. Grafico 1 (Da Munkvold et al., 1999): comparazione della concentrazione di fumonisine tra ibridi Bt e corrispettivi isogenici in seguito ad infestazione manuale (a destra) e naturale (a sinistra). * Indica una differenza statisticamente significativa (P tra ibridi Bt e isogenici. 24

28 9. Fattori mitiganti l efficienza della tecnologia Bt in un reale contesto colturale Nonostante la resistenza agli insetti sia una condizione che può indirettamente contribuire ad una diminuzione delle micotossine nella granella, diversi lavori, tra cui quello condotto in campi commerciali di mais (Dowd, 2001), quindi più rappresentativo del reale contesto colturale, mostrano che sono presenti diversi fattori in grado di mitigare l efficacia della tecnologia Bt nel ridurre le micotossine: - tipo di inserto e linea parentale trasformata; - popolazioni di insetti e funghi patogeni predominanti ed interazione tra essi e la pianta; - condizioni climatiche e ambientali; 9.1. Influenza dell inserto e della linea parentale trasformata - Gli ibridi che esprimono la proteina Cry in tutti i tessuti della pianta, compreso quelli della spiga, risultano essere più efficaci nella difesa della pianta dagli attacchi di piralide rispetto agli ibridi nei quali la proteina è espressa solo in determinati tessuti ed, in generale, mostrano anche una concentrazione di fumonisine inferiore. Questo discorso non è comunque universale: infatti, sebbene il quadro di espressione del MON802 è simile a quello del MON810, sono stati ottenuti risultati molto diversi all interno delle stesse prove: il MON 802 mostrava una concentrazione di fumonisine molto superiore a quella del MON 810 (Munkvold et al., 1999). - Gli ibridi che esprimono il gene a bassi livelli nella spiga mostrano maggior variabilità nel ridurre il danno ed, in generale, sono più efficienti quando l infestazione è tardiva. - Il livello di controllo dell attacco di Helicoverpa zea è risultato variabile, da un quasi totale controllo ad uno quasi nullo (Dowd P.F., 2001) ed, in questo ultimo caso, anche il livello di fumonisine è risultato maggiore. - In generale, è stato riscontrato che quando gli ibridi parentali trasformati erano naturalmente resistenti, si notava una maggior efficienza delle piante Bt nel diminuire la concentrazione di fumonisine. - La seconda generazione degli ibridi Bt, per effetto della segregazione genica della progenie derivante dai semi del primo anno di prove, non mostra effetti positivi sulla concentrazione di fumonisine (Dowd P.F., 2000) sebbene in un reale contesto colturale non sia prevista la risemina della granella raccolta Popolazioni d insetti e funghi patogeni predominanti ed interazione tra essi e la pianta - L espressione della proteina Cry limita solo la presenza di O. nubilalis ed, in parte, di H. zea ma non può interferire sugli altri insetti che possono favorire la penetrazione dei patogeni fungini 25

29 nella pianta. Infatti, i livelli maggiori di riduzione di fumonisina nelle piante Bt si registrano in presenza del solo insetto O. nubilalis. Tale effetto sembra essere seriamente ridotto dalla presenza in campo di H. zea verso la quale il mais transgenico mostra una parziale inibizione. Infatti questo insetto mostra suscettibilità variabile alla proteina Bt fra popolazioni a diversa distribuzione geografica (Dowd P.F., ). - Le ferite inferte dagli attacchi di piralide sembrano favorire solo l infezione di Fusarium verticillioides, mentre, gli altri patogeni fungini tra cui quelli appartenenti al genere Aspergillus sembrano prediligere vie di penetrazione diverse (Magg et al. 2002). - L infezione del fungo è più legata al momento e alla posizione dell infestazione delle larve che al loro numero ed, inoltre, il fungo può infettare la granella in modo asintomatico ed apparire durante la successiva fase di stoccaggio. Questo significa che in seguito a lievi attacchi da parte degli insetti infestanti, l infezione fungina può condurre a forti concentrazioni di micotossine che potrebbero essere sottostimate se si considera la sola fase di campo Condizioni climatiche e ambientali I dati hanno evidenziato elevata variabilità di risposta dei diversi ibridi nelle differenti prove sperimentali, confermando che l efficacia del mais Bt è strettamente correlata alle interazioni con l ambiente. Condizioni climatiche favorevoli all infezione fungina (T, Umidità, ecc.) e fattori che possono creare situazioni di stress alla pianta (squilibri nutrizionali, danni meccanici ecc.) possono incidere in modo considerevole sulla concentrazione di micotossine nella fase di campo. Quindi, le diverse condizioni climatiche e ambientali e le conseguenti fluttuazioni delle popolazioni fungine, limitano l efficacia degli ibridi Bt, nello spazio e nel tempo, esclusivamente verso quei patogeni fungini la cui infezione è strettamente correlata alle ferite inferte dagli attacchi delle larve di piralide. 26

30 10. Conclusioni L infezione fungina e la possibile presenza di micotossine nella granella di mais dipendono da numerosi fattori, sia abiotici che biotici e dalle interazioni tra essi e la pianta. La presenza di un solo carattere di resistenza monogenica, in grado di limitare uno solo di questi fattori, non può essere considerato un sistema efficiente per limitare l attacco dei patogeni fungini, la cui resistenza da parte delle piante è regolata da meccanismi poligenici. A tal proposito è da sottolineare che i lavori analizzati hanno considerato solo gli ibridi Bt e i corrispettivi isogenici, senza considerare quelli naturalmente resistenti provvisti di meccanismi di resistenza poligenica o di campo che, nella lotta contro i patogeni, risulta più duratura nel tempo e meno soggetta alla pressione selettiva di organismi resistenti (Tab. 11). Tab. 11: media della infestazione delle spighe da parte di Ostrinia nubilalis, Helicoverpa zea e media % di spighe commerciabili. La tabella mostra che gli ibridi naturalmente resistenti (ultimi tre in basso) mantengono l attacco di O. nubilalis a livelli tali da contenere i fenomeni di resistenza ma allo stesso tempo hanno una resa di spighe commerciabili simile a quella del mais Bt (Fonte: Burkness et al., 2001). Un altro fattore che potrebbe influenzare la reale efficacia degli ibridi Bt, di cui i lavori analizzati non tengono conto, è il sistema di gestione per preservare la tecnologia Bt imposto dalla National Corn Growers Association ( in collaborazione con l USDA (United States Department of Agricolture). Questo sistema prevede che per evitare l avvento di insetti resistenti, dovuto alla forte pressione selettiva esercitata dagli ibridi Bt che esprimono l endotossina in modo costitutivo, siano istituite delle zone di rifugio coltivate a mais tradizionale. Tali zone devono essere pari al 20% della superficie totale coltivata a mais Bt e, ad una distanza non superiore ai 400 m. Nelle zone dove è coltivato anche il cotone Bt tale superficie viene estesa al 50% del totale (Fig. 2). Bisogna allora chiedersi: - quanto influirà, sulla concentrazione totale di micotossine, la percentuale di granella derivante dalle zone di rifugio durante le fasi successive della filiera? 27

31 - quanto influirà la vicinanza delle colture tradizionali a quelle di mais Bt sugli attacchi di piralide e indirettamente sull infezione fungina? - come sarà trattata la granella derivante dalle zone di rifugio? Tutti questi fattori, soprattutto nel contesto agricolo italiano caratterizzato da piccole e medie aziende, potrebbero incidere in modo molto rilevante nel caso si decidesse di utilizzare le linee guida descritte dalla NCGA attualmente istituite anche in Spagna, primo paese europeo che ha adottato su scala commerciale il mais Bt. Fig. 2: linee guida proposte da American Corn Growers Association in collaborazione con United States Department of Agriculture. Quindi, il confronto tra i soli ibridi transgenici e i corrispettivi isogenici, non può essere considerato significativo della reale diminuzione di micotossine ottenibile attraverso l utilizzo della tecnologia Bt in un reale contesto colturale. In tale contesto, inoltre, l utilizzo delle buone pratiche agricole (GAP), che non è stato tenuto in conto nei disegni sperimentali di tutti i lavori analizzati, risulta di fondamentale importanza per la prevenzione del rischio micotossine (Tab. 12). 28