I marcatori molecolari. Dipartimento di Agraria Sez. di Agronomia, Coltivazioni Erbacee e Genetica Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene

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1 I marcatori molecolari Dipartimento di Agraria Sez. di Agronomia, Coltivazioni Erbacee e Genetica Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene

2 Marcatori molecolari del DNA I marcatori molecolari sono sequenze di DNA variabili che vengono ereditate in modo mendeliano. La trasmissione ereditaria può essere seguita con specifiche tecniche di laboratorio. Un M.M. è un locus genomico rilevabile con sonde o primer specifici, che contraddistingue quel tratto cromosomico. La presenza del M.M. si basa sulla rilevanza di polimorfismi nel DNA di un individuo o tra individui.

3 Marcatori molecolari del DNA I marcatori molecolari contrariamente ai marcatori morfologici ed enzimatici non sono direttamente riferibili all attività di specifici geni. Sono per se non influenzabili dall ambiente e rintracciabili nelle cellule di qualsiasi tessuto o organo (vantaggio!). Inoltre, il loro numero è molto elevato. Un M.M. può essere descritto come un frammento di DNA cromosomico (variabile tra 50 e 3000 bp) compreso tra due regioni oligonucleotidiche note (circa 4-30 bp, sia che si tratti di siti di restrizione o di siti di innesco per la DNA pol.).

4 Marcatori molecolari del DNA L analisi del genoma mediante M.M. è in grado di rilevare la diversità dovuta a eventi di mutazione di regioni omologhe di DNA in individui appartenenti alla stessa specie o a specie diverse. L analisi genomica con M.M. consente la determinazione del fingerprinting molecolare degli individui. Si dispone di numerosi tipi di M.M. che si differenziano per il tipo di sequenze analizzate e/o per il tipo di tecnica utilizzata. Il loro utilizzo negli studi di biodiversità consente per es. di: i)stabilire l unicità della specie; ii)conoscere il livello e la struttura della diversità genetica tra popolazioni ed entro popolazioni; iii)stabilire le relazioni evolutive tra specie/popolazioni; iv)identificare i centri di origine e di diversificazione delle specie/popolazioni; v)definire il sistema riproduttivo ecc.

5 Marcatori molecolari del DNA Un marcatore molecolare è un locus (=posizione sul genoma) rilevabile con: PRIMER Primers PRIMER Locus genico Sonda Sonde che caratterizza il tratto cromosomico e le regioni che lo fiancheggiano

6 Un esempio: mappe di associazione dei primi due cromosomi di Hordeum vulgare ottenute utilizzando marcatori microsatelliti. Disponendo di molti marcatori e riuscendo a capire in che modo sono ordinati sul genoma, è possibile associare fenotipi a zone del genoma e dedurre la posizione di geni non ancora noti

7 Marcatori molecolari del DNA Perché è importante disporre di marcatori? Inoltre, poiché i marcatori sono sequenze di DNA variabili tra individui, esaminando un gruppo di individui (piante, animali, etc.) e stabilendo per quali e quanti marcatori essi differiscono l uno rispetto all altro è possibile ricostruire le relazioni genetiche tra individui ( Sistematica, studi di biodiversità: variabilità tra specie, entro specie)

8 Una importante puntualizzazione Cosa significa che un marcatore è co-dominante? M M Significa che è possibile distinguere i loci omozigoti a 1 /a 1 e a 2 /a 2 da quello eterozigote a 1 /a 2, rappresentati rispettivamente da una sola banda genotipo 1, a 2 /a 2, e genotipo 3, a 1 /a 1 con un solo allele marcatore e da due diverse bande genotipo 2, a 1 /a 2 con entrambi gli alleli marcatori. a 2 /a 2 a 2 a 1 a 1 /a 1 Elevata informatività

9 Marcatori molecolari del DNA I primi ad essere adottati nelle analisi del genoma vegetale sono stati i marcatori RFLP, messi a punto utilizzando particolari enzimi in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di particolari siti (di restrizione) e facendo successivamente ibridare con particolari sonde i frammenti prodotti, attraverso un procedimento ideato da Southern.

10 Marcatori molecolari del DNA Come mezzo di riconoscimento di questa variabilità di sequenza nucleotidica possono essere utilizzati gli enzimi di restrizione. Questi sono proteine prodotte da varie specie di batteri che sono in grado di legarsi al DNA ovunque trovino una corta sequenza specifica di coppie di basi (4-8 a seconda dell enzima) e all interno di questi siti specifici tagliano la molecola di DNA in più frammenti detti di restrizione. DNA genomico Enzima di restrizione Il cambiamento nei siti anche di una sola base (mutazione puntiforme), o mutazioni tra due siti successivi (per delezione, traslocazione, inserzione e inversione), portano a variazione (=polimorfismo) tra i genotipi nella lunghezza dei frammenti di restrizione, cioè ad un RFLP (acronimo dall inglese Restriction Fragment Length Polymorphism)

11 Cromosomi omologhi Cromosomi omologhi Cromosomi omologhi RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (caso di una mutazione puntiforme con perdita di un sito di restrizione) Il cambiamento nei siti anche di una sola base, porta a variazione (=polimorfismo) tra i genotipi, nella lunghezza dei frammenti di restrizione, cioè ad un RFLP. Ipotizzando la perdita di un sito di restrizione per mutazione puntiforme in un organismo diploide: Sito1 Sito2 Sito3 Genotipo 1 Genotipo 2 Genotipo 3

12 Cromosomi omologhi Cromosomi omologhi Cromosomi omologhi RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (caso di una mutazione puntiforme con perdita di un sito di restrizione) r1 r2 r3 restrizione Genotipo 1 restrizione Genotipo 2 restrizione Genotipo 3

13 Cromosomi omologhi Cromosomi omologhi Cromosomi omologhi RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Marcatore codominante restrizione a a b b/b b a a/a a b b Gel agarosio Southern Blotting Pellicola di nylon o nitrocellulosa + Sonda Lastra fotografica

14 Sequenze ripetute: minisatelliti I genomi delle piante, così come quelli di molti altri organismi, includono molte sequenze di DNA ripetute classificate in diverse categorie. Quando la ripetizione è un oligonucleotide di lunghezza variabile normalmente tra i 10 ed i 60 pb è chiamata minisatellite (minisatellite DNA). 3 -ATGGTTCTTGGATT 5 -TACCAAGAACCTAA ATGGTTCTTGGATT TACCAAGAACCTAA ATGGTTCTTGGATT-5 TACCAAGAACCTAA-3 Prima ripetizione in tandem (tandem repeat) Seconda ripetizione in tandem (tandem repeat) Terza ripetizione in tandem (tandem repeat) n volte In un dato locus, il numero di sequenze ripetute, così come il motivo base, può variare.

15 Marcatori molecolari del DNA Nella nostra attività di laboratorio prenderemo in considerazione un tipo di marcatore molecolare: Microsatelliti o SSR via PCR

16 Sequenze ripetute: microsatelliti (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) (Tautz, 1989; Nucl. Acids Res. 17: ) I motivi ripetuti possono essere costituiti da 1-6 paia di basi. In questo caso si parla di sequenze semplici ripetute in tandem (adiacenti) dette SSR (Simple Sequence Repeat) o DNA microsatellite. Dinucleotidiche Esempio : (CA) n CA CA CA n volte Trinucleotidiche Esempio : (CAC) n CAC CAC CAC... n volte Tetranucleotidiche Esempio : (CACT) n CACT CACT CACT... n volte Pentanucleotidiche Esempio : (CACTG) n CACTG CACTG CACTG... n volte

17 Microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) In base alle modalità con cui compaiono le ripetizioni si distinguono i casi in cui il microsatellite è: Puro (Perfetto) Composto Interrotto (CA) n [(CA) n (GA) m ] k (CA) n TT(CA) m TT(CA) k

18 Microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) Sono piuttosto abbondanti nel genoma nucleare delle specie eucariotiche ma non nei procarioti La loro frequenza comunque può variare a seconda degli organismi. Nei mammiferi il motivo più frequente della sequenza ripetuta è (AC) n e (GT) n Da uno studio su 54 specie di piante coltivate: (AT) n >(A) n >(AG) n >(AAT) n >(AAC) n >(AGC) n >(AAG) n >(AATT) n >(AAAT) n >(AC) n

19 SSR o SSLP o STMS (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) Caratteristiche generali Sono individuabili sia nelle regioni codificanti (trinucleotidi in prevalenza) che non codificanti (mono-di-tri-tetra nucleotidi) Sono co-dominanti (cioè sono riconoscibili entrambi gli alleli nei genotipi eterozigoti) Non sono influenzati dall ambiente Sono identificabili in tutti i tessuti vegetali ed in tutti gli stadi di sviluppo ontogenetico Non manifestano fenomeni di pleiotropia o epistasia Presenti nel genoma del cloroplasto (CpSSR)

20 Microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) Il polimorfismo ad un dato locus in una specie è dovuto alla variazione di lunghezza del microsatellite. Ogni variante in lunghezza è un allele microsatellite L allele è quindi definito dal numero di volte in cui è ripetuto il motivo di base Gen. 1 Gen. 2 Gen. 3 Gen. 4 Gen. 5 Gen. 6 Quanti alleli diversi? 3 7 ripetizioni 5 10 ripetizioni 2 11 ripetizioni 1 12 ripetizioni 1 13 ripetizioni 12 alleli di cui 5 diversi

21 Microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) Mutazioni di lunghezza sono attribuibili in vivo a: Replication slippage (scivolamento reciproco dei filamenti del DNA) durante la replicazione del DNA. Crossing over ineguale tra cromosomi omologhi durante la replicazione del DNA (ricombinazione mitotica/meiotica). Esperimenti in vitro Studio sulla distribuzione delle mutazioni Errori del sistema di riparazione delle basi del DNA (Strand et al., 1993). Ne consegue l inserzione o la delezione di uno o più elementi del motivo ripetuto lungo la sequenza (tasso di mutazione = 10-4 per divisione cellulare) con conseguente espansione o contrazione della sequenza microsatellite.

22 SSR e SSLP o STMS (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) La strategia si fonda sull osservazione che le sequenze fiancheggianti in 3 e 5 un determinato locus microsatellite nel genoma sono conservate all interno delle specie, fra specie, fra specie all interno di un genere e, anche tra generi affini. PRIMER Locus microsatellite PRIMER Sequenza fiancheggiante conservata Sequenza variabile Sequenza fiancheggiante conservata Conoscendo le sequenze fiancheggianti il microsatellite, è dunque possibile sintetizzare primers per l amplificazione selettiva di singoli loci microsatelliti

23 SSR e SSLP o STMS (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) atagagcaat tgtttttgaa gtatttgaga attgttaagg tctcttcact agatcactat 300 gaaatccttt ctcaccacta ccatgattta tgaccaagtc cttcaactat gtcacatgct 360 tacctttctt gtgagtcgta gtctagctac atgacacaat tcttagggac catattcttg 420 atatcacttc tctgactcat aaacaaagat aatatatata tatatatata tatatatatg 480 atcagttttt ttattgatct acaatatcca tctcaatatt ttaaatatat cattgcttca 540 catattccac tgatttccaa agaagtcaat gtagaatgac aatgtgaaaa tcatttttta 600 agtcgtagtctagctacatga primer forward atatatatatatatatatatatatatat regione microsatellite da amplificare cattgcttcacatattccactg primer reverse

24 SSR e SSLP o STMS (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) 5 ---attgtgatgccgtagtcgagagagagagagagagcgctcttaggccaatt Forward primer Reverse primer 3 ---taacactacggcatcagctctctctctctctctctcgcgagaatccggttaa c. 30 cicli PCR Crescita esponenziale della sequenza microsatellite bersaglio

25 SSR e SSLP o STMS Gen M (pb) Gen Gen Gen Gen. 5 Gen. 6 = siti di annealing dei primers Gel di poliacrilammide +

26 Gel Genotipi M Matrice Genotipo Locus , , , , , ,160

27 Limitazioni degli SSR (Simple Sequence Repeat o Simple Sequence Length Polymorphism) OMOPLASIA: identità in stato ma non per discendenza (identity in-state ma non identity-by-descent Wright, 1965) E in parte conseguenza del meccanismo mutazionale alla base degli SSR Nel caso dei microsatelliti: Allele A CACACACA Allele A CACACACA Allele A CACACACA Allele B CACACACACA Allele B CACACACACA Allele C --CACACA N.B. Diremo che due individui condividono un allele se uno ha l allele B e l altro l allele B. Ma gli alleli pur essendo uguali in stato (sequenza) hanno antenati diversi. Paradosso: rischiamo cioè di concludere che individui che discendono da antenati diversi sono più simili che individui che discendono dallo stesso antenato!!!

28 Un caso di studio: Identificazione di cultivars del vitigno Sangiovese in Toscana Vignani et al., EJB Vol. 5 No. 1, Issue of April 15, 2002.

29 Materiali e metodi 25 cloni presunti di SANGIOVESE da diverse aree della Toscana Le piante utilizzate come controlli e come standard per le dimensioni alleliche sono anche disponibili in commercio. Nella tabella sono indicate da frecce verdi. = sospetti in base ai rilievi ampelografici Vino D.O.C. Morellino Migl. Gen. (ARSIA)

30 METODO Estrazione DNA vegetale separatamente di ciascuno dei 25 individui Analisi del polimorfismo di 8 loci microsatelliti in ciascun individuo via PCR (=necessarie 8 coppie di primers diversi) In ogni provetta: -DNA -dntp -2 primers -Taq polimerasi -MgCl 2 -Tampone di reazione PCR X 8 loci Elettroforesi e lettura gel

31 Risultati = sospetti in base ai rilievi ampelografici

32 Risultati E possibile trarre qualche conclusione? In accordo con la definizione di popolazione di origine monoclonale le tre accessioni divergenti non dovrebbero essere incluse in Sangiovese.