Dr. Tommaso Giordani SEQUENZIAMENTO SANGER E ANALISI DI SEQUENZE DI DNA

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1 Dr. Tommaso Giordani SEQUENZIAMENTO SANGER E ANALISI DI SEQUENZE DI DNA

2 OBIETTIVI DELLA GENOMICA MAPPE GENETICHE e FISICHE sempre più accurate SEQUENZIAMENTO GENOMI GENOMICA COMPARATIVA confronto tra genomi di specie diverse (evoluzione) ANNOTAZIONE Identificazione di tutti i geni e delle altre sequenze significative PRODUZIONE DI DATABASE per l accesso alle informazioni

3 Programma - Il sequenziamento col metodo Sanger; - Il programma Chromas usato per la lettura dell output dei sequenziatori automatici; - Il software ClustalW per l allineamento di diverse sequenze di DNA; - La ricerca nei database molecolari attraverso l uso di BLAST; - La definizione delle strutture geniche con l uso di GenScan; - Translate Tool: software per la traduzione di sequenze di DNA. - Annotazione di retrotrasposoni attraverso l uso di LTR-finder e J-Dotter.

4 IL SEQUENZIAMENTO Il termine sequenziamento, in biologia molecolare, indica il processo per la determinazione dell'esatta struttura primaria di un biopolimero. Nel caso del DNA, serve a mettere in fila le basi (A, C, G e T) che costituiscono il frammento di DNA in analisi, in modo da poterlo leggere propriamente ed analizzare. CATCTGAATTAACAAAAATTACCATTCGAACACTCATTTACACCACTTGTATTTTT ATTTGCATTTGGATTTGGATTTGCAGAACCAGAATTTAAAACATCGTCAATCGTAA CACTCTGATATGCAGATAACTGAACCTGATCACCGACCAATCGAGCGTCTTCAAAC TCAATATCTATGTTTTGTCCGGTCCTGCTATGTGATTCCATTGAAAACAACAGTTG ATTCAAACCCTAACGCAGAACAACGAAACTGCAATGTATTGTTTGAGAATTATGAA AAAAAT

5 I primi metodi erano piuttosto complicati. Ad es.il metodo sviluppato da Allan Maxam e Walter Gilbert (1976) si basava su modificazioni chimiche del DNA e sul conseguente taglio in posizioni specifiche e venne progressivamente accantonato a causa della complessità tecnica e dell'uso estensivo di sostanze tossiche. La metodica principalmente utilizzata finora si basa su una strategia enzimatica, metodo della terminazione della catena sviluppato da Frederick Sanger (1977). (Più recentemente sono stati sviluppati nuovi metodi caratterizzati dalla capacità di sequenziare molti frammenti di DNA contemporaneamente (anche se con efficienza minore in termini di numero di basi sequenziate per frammento) aprendo una nuova era del sequenziamento. Queste metodiche vanno sotto il nome di sequenziamento ad elevato parallelismo o NEXT GENERATION SEQUENCING. Le vedremo in futuro)

6 IL SEQUENZIAMENTO SANGER Il sequenziamento Sanger è detto enzimatico perché prevede l uso di un enzima, la DNA polimerasi, che, iniziando da un primer complementare alla regione del DNA stampo, utilizza i quattro deossinucleotidi (datp, dctp, dgtp, dttp) per allungare la catena.

7 La metodica Sanger si basa sulla replicazione del DNA

8 Nella reazione di sequenziamento, oltre a deossinucleotidi normali, vengono utilizzati nucleotidi modificati (dideossitrifosfati, ddntps) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche (metodo della terminazione della catena). I ddntps sono molecole artificiali corrispondenti ai nucleotidi naturali, ma si differenziano per l'assenza del gruppo OH sul carbonio 3' dello zucchero, impedendo così che un altro nucleotide si leghi ad essi, in quanto non si possono formare legami fosfodiesterici (DNA chain terminators). Confronto tra deossiadenosina (sopra) e dideossiadenosina (sotto). Notare la mancanza del gruppo -OH che impedisce il legame di un altro nucleotide, provocando la terminazione della polimerizzazione.

9 Il campione di DNA da sequenziare viene diviso in quattro reazioni separate, ognuna delle quali contiene, oltre al DNA stampo, un primer, la DNA polimerasi e tutti e quattro i dntps. Ad ognuna di queste reazioni viene poi aggiunto solo uno dei quattro ddntps marcato con isotopo radiattivo (o con fluorocromi) in quantità stechiometricamente inferiore ai dntps per permettere una elongazione del filamento sufficiente per l'analisi.

10 L'incorporazione di un dideossinucleo1de lungo il filamento di DNA in estensione ne causa la terminazione prima del raggiungimento della fine della sequenza di DNA stampo. Questo dà origine ad una serie di frammen1 di DNA di lunghezza diversa in corrispondenza dell'incorporazione del nucleo1de dideossi, che avviene casualmente quando esso è u1lizzato dalla polimerasi. * * * * Alla fine le 4 reazioni si fanno correre su gel di poliacrilammide il quale viene autoradiografato.

11 Le 4 reazioni si fanno correre su gel di poliacrilammide dove I frammenti vengono poi separati in base alla loro lunghezza. Il gel di poliacrilamide permette di separare frammenti che differiscono come lunghezza anche di una singola base, quindi vengono visualizzati su lastra fotografica. Nella figura i ddntps sono stati marcati radioattivamente e le bande scure corrispondono ai vari frammenti di lunghezza diversa. Le posizioni relative delle bande nelle quattro corsie sono utilizzate per leggere la sequenza (dal basso verso l'alto). Seq.: TACGAGATAT

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13 Adesso si usano sequenziatori automatici che permettono di mettere tutti i ddntps (marcati con quattro coloranti fluorescenti differenti fluorocromi) dentro un unica reazione, la quale viene fatta correre dentro un capillare. Ogni filamento di DNA emette una luce di colore diverso in base al ddntp col quale termina. Alla fine del capillare c è un sensore che registra il passaggio dei vari ddntps fluorescenti. Gli output sono curve di assorbimento (una per ogni ddntp) chiamati ferogrammi.

14 Ciò che leggono i 4 sensori per i 4 fluorocromi:

15 IL FEROGRAMMA

16 Filma1 da aprire con Flash Sanger_ sequencing.swf Sanger_ sequencing2.swf Capillary electrophoresis.swf Reading squence.swf Cycseq

17 CHROMAS Il software Chromas (o CodonAligner per mac) permette di leggere l output dei sequenziatori, cioè i FEROGRAMMI. In particolare con Chromas riusciamo a osservare non solo la sequenza del frammento di DNA che abbiamo sequenziato, ma anche la bontà del ferogramma. File 00,01 File 00 e 01 con file pdf per la qualità e file ABI come esempio di ferogramma brutto

18 CASO PRATICO (1) Mettiamo di avere un amplificato ottenuto da PCR utilizzando due primers: come ci comportiamo per sapere a che cosa corrisponde? 1. Sequenziamento del frammento utilizzando sia il primer forward che il primer reverse; 2. Montaggio delle due sequenze al fine di ottenere una sequenza nucleotidica più vicina possibile alla realtà; 3. Ricerca della sequenza sui database.

19 5 -ATGGGACTGATCAGTTAGGCTTAAT...TCTCCTGAATGCCGATGCATGAC-3 3 -TACCCTGACTAGTCAATCCGAATTA...AGAGGACTTACGGCTACGTACTG-5 5 -ATGGGACTGATCAGTTAGGCTTAAT...TCTCCTGAATGCCGATGCATGAC-3..GGACTTACGGCTACGTACTG ATGGGACTGATCAGTTAGGCTT.. 3 -TACCCTGACTAGTCAATCCGAATTA...AGAGGACTTACGGCTACGTACTG-5 TGACTAGTCAATCCGAATTA...AGAGGACTTACGGCTACGTACTG ATGGGACTGATCAGTTAGGCTTAAT...TCTCCTGAATGCCGATGCA

20 CLUSTAL- W Clustal-W è uno dei software più usati per la comparazione di sequenze nucleotidiche e amminoacidiche. Compie un allineamento tra due o più sequenze diverse, evidenziando le identità e le differenze. Nel caso in esame serve per valutare quale sia il modo migliore per montare le sequenze FOR e REV del frammento di DNA al fine di ottenere una sequenza unica. Ma questo è solo uno dei moltissimi usi che si fanno di questo tool. File 02, 03, 04, 05, 06 FILE 02, 03, 04, 05, 06

21 CLUSTAL-W La comparazione delle sequenze geniche fra diverse specie permette di comprendere l evoluzione di un gene in termini molecolari Esempio di comparazione delle sequenze nucleotidiche di uno stesso gene fra specie diverse

22 B.L.A.S.T. BLAST è l acronimo di Basic Local Alignment Search Tool (ovvero strumento di ricerca di allineamento locale ) ed è un algoritmo usato per comparare sequenze proteiche o nucleotidiche con sequenze depositate in banche dati. Una ricerca BLAST permette di confrontare una sequenza con un database di sequenze già conosciute, e di identificare tra queste quelle che presentano le maggiori somiglianze: possiamo così risalire alla funzione della stessa.

23 GENSCAN GenScan è un tool che ci permette, una volta inserita una sequenza genica, di predire la struttura del gene stesso, identificando esoni, introni e siti di poliadenilazione basandosi sulle sequenze tipiche degli stessi, come ad esempio codoni di start e stop. Possiamo verificare l effettivo funzionamento del programma confrontando il suo output con la sequenza del cdna del gene corrispondente. File 07 File 07

24 TRANSLATE TOOL Si trova sul sito di ExPASy ed è un tool che, partendo da una sequenza di DNA, fornisce tutte le sei possibili sequenze aminoacidiche dedotte dalla traduzione dalla sequenza stessa. Di tutti i frame scritti nell output, ovviamente, solo uno è quello reale. File 08 File 08

25 La comparazione delle sequenze aminoacidiche dedotte dalle sequenze geniche permette di comprendere l evoluzione di una proteina ed il suo grado di conservazione nei diversi organismi First 90 positions of a protein multiple sequence alignment of a ribosomal protein from several organisms

26 La comparazione delle sequenze aminoacidiche dedotte dalle sequenze geniche permette di comprendere il grado di correlazione fra le proteine di una famiglia genica Allineamento multiplo di sequenze fra proteine diverse. Gli aminoacidi evidenziati in nero sono altamente conservati. Le posizioni marcate con il punto in alto sono identiche in tutte le proteine della famiglia. La sequenza consensus definisce una stringa valida per tutti i membri della famiglia.

27 CASO PRATICO (2) Isolamento di un gene (es. codificante per una Deidrina) dal genoma di una certa specie da cui ho estratto il DNA genomico e determinarne la sequenza? 1. Ricerca su NCBI di sequenze geniche omologhe di altre specie; 2. Multiallineamento tra le sequenze (ClustalW); 3. Individuazione di sequenze conservate e costruzione di primer; 4. PCR e sequenziamento. File 09 File 09

28 Riassunto Sequenziamento Sanger Chromas (ferogramma) Montaggio sequenza Ricerca di omologie (BLAST) Allineamento di sequenze (ClustalW) Isolamento di geni Analisi di sequenze geniche: - StruWura di geni (GENSCAN) - Traduzione (Translate tool) Analisi di variabilità gene1ca

29 SCHEMA DEI TIPI DI SEQUENZE CHE COMPONGONO IL GENOMA NUCLEARE DEI VEGETALI Geni Geni ribosomali (rdna): geni per l rrna 5S con spaz. intergenici geni per gli rrna 18-5,8-25S con spaz. intergenici Istoni trna Altri RNA: snrna, mirna Geni strutturali (mrna) spesso organizzati in famiglie geniche. Nelle piante generalmente a basso numero di copie (comprese le sequenze regolatrici e gli introni) Sequenze non codificanti SEQUENZE DI DNA RIPETUTE IN TANDEM COPIE CON SEQUENZE DEGENERATE SEQUENZE DI DNA RIPETUTE DISPERSE Pseudogeni Sequenze centromeriche, telomeriche (ripetizione CCCTAAA) Trasposoni a DNA Microsatelliti (1-5 pb) Minisatelliti (fino a 50 pb) DNA satellite solo-ltr Retrotrasposoni con LTR e non-ltr (LINE, SINE)

30 Schema dell organizzazione del genoma eucariooco SEQUENZE UNICHE O POCO RIPETUTE: Geni codificanti proteine (spesso organizzati in famiglie geniche) Pseudogeni Trasposoni o relitti di trasposoni SEQUENZE RIPETUTE

31 SEQUENZE RIPETUTE Sono sequenze che si ripetono uguali a loro stesse entro lo stesso genoma. Ne esistono di diversi tipi: - SEQUENZE RIPETUTE IN TANDEM (rdna, minisatelliti, microsatelliti, sequenze centromeriche, telomeriche, DNA satellite) -DNA RIPETITIVO INTERSPERSO (elementi trasponibili) - Trasposoni a DNA (o Trasposoni); - Trasposoni a RNA (o Retrotrasposoni): - Senza LTR (LINE, SINE); - Con LTR (Ty3-Gypsy, Ty1-Copia, LARD)

32 RETROTRASPOSONI CON LTR Struttura Ty3-Gypsy Struttura Ty1-Copia Struttura LARD

33 DOMINI TIPICI DEI RE CON LTR LTR Long Terminal Repeats ripetizioni dirette che fiancheggiano l elemento da entrambe le estremità. Cominciano tipicamente con TG- e finiscono con -CA. TSR Target Site Repeat ripetizione diretta di 4-6 bp che fiancheggia il retroelemento. E il segno dell inserzione. PBS Primer Binding Site sequenza di 18 bp complementare alla coda 3 dei trna. PPT Poly Purine Trait tratto di bp ricco in purine (A, G). PBS e PPT sono importanti per la retrotrascrizione.

34 LTR- FINDER LTR-finder è un programma che trova retroelementi a LTR su una sequenza (in formato FASTA) che l utente inserisce. VANTAGGI - Comodo e veloce in quanto rileva in pochi secondi tutte le sequenze tipiche dei RE; - Affidabile. SVANTAGGI - Non individua tutti i RE di una sequenza.

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36 J- DOTTER hqp:// J-dotter è un software per fare i dot-plot: grafici cartesiani dove su ascisse e ordinate mettiamo due sequenze a confronto e dove il programma mette un punto in corrispondenza di basi uguali. T G T C A A G T A G X X A X X X T X X X T X X X A X X X A X X X C G X X G X X X Il dot-plot dà una veloce raffigurazione visiva del rapporto di similarità tra due sequenze.

37 J- DOTTER E RETROELEMENTI Questa applicazione può esserci molto utile per l annotazione di retrotrasposoni a LTR, come? Le LTR sono ripetizioni dirette della stessa sequenza. Quindi se su J-Dotter metto lo stesso frammento di DNA su ascisse e ordinate, due regioni simili situate all interno del frammento di DNA saranno evidenziate. Le linee che vediamo sui grafici possono essere ripetizioni dirette e inverse a seconda del loro orientamento, e le ripetizioni dirette possono essere LTR di retrotrasposoni.

38 J- DOTTER E RETROELEMENTI T G T C A A G T A G X X A X X X T X X X C x A X X X A X X X G x x T x x x A x x x

39 orizz LTR 5 LTR 3 vert Allineamento per l intera lunghezza (diagonale nel dotter) orizz vert

40 Allineamento per l intera lunghezza (diagonale nel dotter)

41 Allineamenti sfalsati (brevi diagonali nel primo o secondo quadrante del dotter) orizz vert vert orizz

42 Ripe1zioni direwe, LTR? File 11 e12 File 11 e 12

43 Tandem repeat finder Tandem repeat finder è un programma che trova sequenze ripetute in tandem su una sequenza (in formato FASTA) che l utente inserisce. -Comodo e veloce e preciso in quanto rileva in pochi secondi tutte le sequenze ripetute in tandem, fornendo anche una sequenza consenso - Affidabile. -Come LTR finder, è in grado di processare sequenze multiple

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45 Qua sono mostrate solo 4 delle 16 ripe1zioni. File 13