TERRENI DI COLTURA. LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) SOLIDI: contengono AGAR.

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Lucia Barbara Mauro
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1 TERRENI DI COLTURA Sono dei substrati contenenti diverse sostanze nutritive (o in alcuni casi TOSSICHE) che vengono utilizzati per la crescita di organismi di diversa tipologia (batteri, funghi, vegetali ecc). Possono essere LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) SOLIDI: contengono AGAR.

4 TERRENI DI COLTURA LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) SOLIDI: contengono AGAR. agar Serve per solidificare i terreni di coltura È un polisaccaride contenente zolfo estratto da un alga marina. Reperibile in commercio in forma essiccata pura, si disidrata facilmente. Ci sono vari tipi di agar che hanno proprietà fisiche diverse. Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificante nei terreni di coltura. Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato complesso formato da molecole di galattosio. Liquefazione a 97/100 C; solidificazione a 42/ 45 C I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le temperature. E insolubile a temperatura ambiente; il completo scioglimento avviene in autoclave

5 Agar

6 L uso dell agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare Inoltre: non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;

7 Preparazione di un terreno solido: le capsule o piastre Petri Il terreno contenente agar sciolto (50 C) è versato nella capsula Quando la la temperatura si abbassa il terreno gelifica (passaggio sol > gel)

8 Inoculare un terreno solido (NEL CASO DI BATTERI): Lo striscio: ansa sterile

10 Le regole fondamentali di asetticità sono: la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente sterilizzare la vetreria e il materiale usati disinfettare e pulire il banco da lavoro accuratamente sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto

11 4. Regolatori di crescita ESSENZIALI Le auxine Le citochinine NON ESSENZIALI Le gibberelline (GA) L acido abscissico (ABA) L etilene 11

12 Regolatori di crescita Auxine Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3- Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) meno costosi e più stabili Stimolazione della distensione cellulare in fusti e coleoptili Promuovono la radicazione Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in quelli apicali (inibizione della crescita delle gemme laterali) 12

13 Regolatori di crescita Citochinine Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Un solo composto naturale la Zeatina; analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e Kinetin Stimola la divisione cellulare Promuove la formazione di gemme avventizie Sono sintetizzate nel meristema radicale e trasportate nel floema sotto forma di Zeatinriboside 13

14 Regolatori di crescita Gibberelline Questa classe comprende più di 70 composti, varie forme dell acido gibberellico In commercio sono disponibili diversi formulati (GA 3, GA 4, GA 9 ) Stimola l eziolatura dello stelo Sintetizzate nelle giovani foglie 14

15 Regolatori di crescita Acido abscissico (ABA) Esiste solo un componente naturale Promuove l abscissione delle foglie e la dormienza dei semi Gioca un ruolo dominante nella chiusura degli stomi in condizioni di stress idrico Ha un ruolo importante nell embriogenesi (aiuta la formazione di embrioni normali) 15

16 Auxine Alte Bilancio ormonale Citochinine Basse Formazione di radici dopo il taglio Embriogenesi Formazione di radici avventizie Induzione a callo Formazione di germogli avventizi Crescita di germogli ascellari Basse 16 Alte

17 Rapporto auxine : citochinine 17

18 Mezzo di coltura in vitro Elementi minerali (17 elementi essenziali) Fonte d energia e di carbonio (saccarosio) Regolatori di crescita (fitormoni) Vitamine Composti organici Acqua ph ( ) Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum 18

20 Composti inorganici Macroelementi (>mg/l di N, P, K, Ca, Mg e S) e microelementi (<mg/l Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I, Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si). Disponibili formulazioni commerciali in polvere Murashige and Skoog Medium (1965) è il mezzo di coltura più comune Il mezzo Gamborgs B5 è più diffusamente utilizzato per colture cellulari in sospensione. 20

21 Vitamine Un ampio range di vitamine sono disponibili e possono essere usate Generalmente, più è piccolo l espianto, più appropriata deve essere la scelta della/e vitamine Un cocktail di vitamine è spesso usato L inositolo di solito deve essere aggiunto a maggiori concentrazioni (100mg/l) 21

22 Vitamine Tiamina Piridossina Acido nicotinico Biotina Acido Citrico Acido Ascorbico Myo-inositolo 22

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