GENOMICA STRUTTURALE: GENOMICA FUNZIONALE: 1. Anatomia dei genomi. 8. Funzionamento dei genomi Il genoma dei procarioti

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1 GENOMICA STRUTTURALE: GENOMICA FUNZIONALE: 1. Anatomia dei genomi 8. Funzionamento dei genomi Il genoma dei procarioti Modificazioni della cromatina e l espressione del genoma Il genoma degli eucarioti Microarray e RNA-seq 2. La mappatura dei genomi Metil-seq Mappatura genetica Chip-seq Mappatura fisica 3. Il sequenziamento automatico del DNA Il principio del sequenziamento secondo Sanger Il sequenziamento su larga scala La lettura dei tracciati di sequenziamento 4. Il sequenziamento del genoma I nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento gerarchico Il sequenziamento shogun Piattaforme di sequenziamento di interi genomi La verifica delle sequenze e assemblaggio dei contig 5. L annotazione del genoma Il sequenziamento delle EST Le caratteristiche funzionali delle sequenze genomiche 6. I Progetti Genoma Il Progetto Genoma Umano Il Progetto Genoma Animali Il Progetto Genoma Piante Il Progetto Genoma Microrganismi 7. Genotipizzazione Gli SNP e la variazione La genotipizzazione degli SNP

2 HowmuchDNA codesforproteins

3 GENOMICA STRUTTURALE: 3. Il sequenziamentoautomatico del DNA Il principio del sequenziamento secondo Sanger Il sequenziamentosu larga scala La lettura dei tracciati di sequenziamento

4 Dalla Genetica e alla Genomica Mendel eredità dei caratteri Sutton1903 -i geni sui cromosomi Griffith il fattore trasformante Avery, MacLoad, MacCarty 1944 DNA materiale genetico Watson & Crick 1953 il DNA èuna doppia elica Sanger sequenziamento proteina Crick scoperta del trna mappaggio codoni Leder introni Sanger& Gilber 1977 sequenziamento DNA Mullis1990 PCR Schena, Brown& Davis 1995 microarray Altschul et al BLAST 1990 gene knockout, RNAi sequenziamento genomi S. cerevisae C. elegans 2000 Arabidopsis thaliana Homo sapiens

5 Date storiche della sequenza del DNA Averypropone il DNA come materiale genetico Miescher osserva per la prima volta il DNA Watson e Crick determinano la struttura della doppia elica Holleysequenza il trna di lievito METODO SANGER (terminazione di catena) METODO MAXAM-GILBERT (degradazione chimica) KARY MULLIS Introduce la PCR Vengono sviluppate le tecniche per la sintesi degli oligonucleotidi e per la degradazione chimica del DNA. Viene introdotta l elettroforesi su gel per la Separazione di frammenti di DNA Il DNA genomico viene clonato nel fago M13 o in vettori plasmidici, nascono i primi programmi informatici di analisi dei dati, vengono sviluppate nuove tecnologie per il sequenziamento Automazione completa Sequenziamento completo del genoma umano 2001 AUTOMAZIONE PARZIALE Vengono sviluppate le prime apparecchiature per il sequenziamentoche impiegano sistemi per la rilevazione della fluorescenza.

6 Metodi di sequenziamento Sanger(enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

7 Metodo di Sanger deossiribosio dideossiribosio

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9 primer quattro dntp ddntp DNA polimerasi ddttp ddctp ddgtp ddatp nuovo DNA primer dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddntp è incorporato al posto di un dntp Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

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13 Maxam e Gilbert DIMETILSOLFATO(DMS) Basi puriniche Metila preferenzialmente i residui G sull azoto N(7). In ambiente acido metila in eguale misura sia i residui G che i residui di A IDRAZINA Basi pirimidiniche Modifica sia i residui C che T. In ambiente salino (1,5M NaCl) modifica preferenzialmente i residui C In corrispondenza di ogni base modificata si fa agire un agente idrolizzante la PIPERIDINAche idrolizza la catena di DNA nella posizione in cui si trova la base modificata.

14 Metodo di Maxame Gilbert 32 P DNA singolo filamento marcato ad una estremità 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

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