1950, Erwin Chargaff AT e GC circa costanti in tutte le specie: consistente con l ipotesi del modello di Watson-Crick

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Felice Riccardi
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1 1950, Erwin Chargaff AT e GC circa costanti in tutte le specie: consistente con l ipotesi del modello di Watson-Crick

kb (chilo coppie) lunghezza batteriofago T2 166 55 µm Escherichia

36 mm Drosophila 65000 2 cm (in 1 cromosoma dei 4 presenti) Uomo

2 Il genoma di E. coli ha 4.0 milioni di nucleotidi Le dimensioni del DNA in vivo Organismo kb (chilo coppie) lunghezza batteriofago T µm Escherichia Coli mm Drosophila cm (in 1 cromosoma dei 4 presenti) Uomo (in 23 cromosomi) Cromosomi umani e di cervo asiatico m Genoma quasi grande come quello umano con tre coppie di cromosomi (cfr con due cromosomi umani)

3 Rosalind Franklin lab. di Wilkins, Kings College Londra Diffrazione ai raggi X di fibre di DNA-B Na+ James Watson e Francis Crick interpretano i dati e propongono un modello strutturale a doppia elica (1953) motivo a croce elica 10 residui per giro due filamenti (dati di densità delle fibre) appaiamenti A-T C-G Nobel 1962 (condiviso con Wilkins)

successive) Filamenti antiparalleli Elica destrorsa Appaiamento secondo Watson e Crick: spiega la regola di Chargaff i legami

4 Le basi sono perpendicolari all asse dell elica interazioni di van der Waals tra le basi impaccate. 3.4 Å = doppio dello spessore di van der Waals per anelli planari passo 34 Å 10 coppie di basi per giro (36 di rotazione tra basi successive) Filamenti antiparalleli Elica destrorsa Appaiamento secondo Watson e Crick: spiega la regola di Chargaff i legami glicosidici di una coppia di basi distano sempre Å: solo le coppie A-T e C-G soddisfano il requisito ogni coppia può essere inserita senza distorsioni dello scheletro legami a idrogeno

catene di polinucleotidi avvolte attorno ad un asse e che corrono in

6 Watson-Crick: modello - DNA duplex Basi separate di 3.4 Å 10 basi / giro 36 gradi / base passo: 34 Å diametro elica: 20 Å Due catene di polinucleotidi avvolte attorno ad un asse e che corrono in direzione opposta Scheletro di zucchero-fosfato esterno, basi interne Basi quasi perpendicolari all asse dell elica

7 Vista assiale del DNA Basi accoppiate e stacked una sull altra, danno un contributo alla stabilità: 1. Forze di van der Walls 2. Effetto idrofobico 3. Legami a H

8 Le catene complementari agiscono reciprocamente da STAMPO nella replicazione del DNA Watson e Crick pubblicano l ipotesi di replicazione in base al loro modello: Dato l ordine reale delle basi di una catena, si potrebbe scrivere l ordine esatto delle basi sull altra catena, perché l accoppiamento è specifico. Una catena è quindi, per così dire, il complemento dell altra, ed è questa caratteristica che suggerisce il modo in cui la molecola di acido deossiribonucleico si potrebbe duplicare Ora, il nostro modello [ ] è, in effetti una coppia di stampi, ciascuno complementare all altro. Noi immaginiamo che prima della duplicazione i legami a idrogeno si spezzino e che le due catene si svolgano e si separino. Ciascuna catena agisce quindi da stampo per la formazione di una nuova catena, così che alla fine avremo due coppie di catene dove prima ne avevamo una sola. Inoltre, la sequenza delle coppie di basi sarà duplicata esattamente

9 DNA-parentale conservativa Semi-conservativa dispersiva REPLICAZIONE

10 La replicazione del DNA è semiconservativa Esperimento di Meselson e Stahl 1958 Marcatura del DNA con 15N batterio E.coli cresciuto per 14 generazioni in 15NH4Cl trasferimento veloce in terreno 14N misura di densità del DNA in funzione del tempo di crescita con il metodo della ultracentrifugazione all equilibrio in gradiente di densità (1% di differenza nella densità di DNA pesante e leggero)

N DNA & 15N DNA 14 1958, Meselson & Stahl experiment, resolution by

11 N DNA & 15N DNA , Meselson & Stahl experiment, resolution by density gradient centrifugation. UV absorption photo of cell, 2 distinct DNA bands

12 Densitometer tracing of UV photograph

Semiconservative replication of DNA Generation 0 1 1.

13 Semiconservative replication of DNA Generation % 15N Position of DNA band depends on its content of 14 N and 15N 50% 15N & 14N in hybrid helix 2 bands, 14N(100%) & hybrid helix UV absorption photo of DNA density gradients, DNA replicated in E. coli

14 Densitometer tracing of UV photographs 100% 15N in both strands 50% 15N and 14 N in hybrid helix 2 bands, 14N(100%) and hybrid helix

struttura ai RX Dickerson e Drew (anni 70) Le basi sono

15 DNA-B : i due solchi deviazioni dal modello: le irregolarità sono sequenza-specifiche dodecamero d(cgcgaattcgcg): struttura ai RX Dickerson e Drew (anni 70) Le basi sono perpendicolari all asse dell elica passo 34 Å, 10 coppie di basi per giro

Forze d interazione nella struttura del DNA interazioni idrofobiche: interno idrofobico (basi impaccate) esterno idrofilico (gruppi fosfato) legami a idrogeno tra basi complementari forze

16 Forze d interazione nella struttura del DNA interazioni idrofobiche: interno idrofobico (basi impaccate) esterno idrofilico (gruppi fosfato) legami a idrogeno tra basi complementari forze di van der Waals, nello stacking delle basi (forze deboli ma additive) interazioni elettrostatiche: destabilizzanti tra i gruppi fosfato, neutralizzate da cariche positive (ioni, proteine)

17 Le strutture a doppia elica sono strutture rilassate, non ci sono costrizioni conformazionali Lo scheletro di zuccheri-fosfato non è una struttura rigida In seguito a separazione dei filamenti conformazione casuale

18 DNA Duplex può essere denaturato reversibilmente

19 Fusione della doppia elica denaturazione del DNA per riscaldamento: processo cooperativo e reversibile Temperatura di fusione Nella cellula alcune proteine dette elicasi sfruttano l energia dell ATP per separare i filamenti

20 Tm aumenta in modo lineare con la frazione molare delle coppie C-G coppie unite da triplo legame a H DNA parzialmente fuso Zone ricche in C-G Zone ricche in A-T

21 A, B e Z DNA DNA è in forma B nella cellula Una piccola frazione può essere localmente in forma Z, dove c è alternanza di basi puriniche e pirimidiniche La forma A è presente in RNAduplex e negli ibridi DNA-RNA

ibride DNA-RNA sono nella forma A elica destrorsa più larga e piatta: passo 28 Å 11

22 DNA-A Le fibre di DNA preparate in condizioni di bassa umidità (75%) assumono la forma A Le molecole di RNA-duplex sono nella forma A (effetto dell ossidrile) Le molecole ibride DNA-RNA sono nella forma A elica destrorsa più larga e piatta: passo 28 Å 11 basi per giro buco assiale di diametro 6 Å piani delle basi inclinati di 20 rispetto all asse

23 Lo scheletro di zucchero-fosfato restrizioni steriche limiti negli angoli di torsione C3 DNA-A C2 DNA-B DNA-Z nucleotidi purinici (A;G) C3 -endo, nucleotidi pirimidinici (T;C) C2 -endo

) Conformazione favorita in alta concentrazione salina Sequenza a basi puriniche e pirimidiniche

24 DNA-Z Wang e Rich determinano la struttura del cristallo d(cgcgcg) Funzione biologica (interruttore nella regolazione dell espressione genetica?) Conformazione favorita in alta concentrazione salina Sequenza a basi puriniche e pirimidiniche alternate elica sinistrorsa 12 basi per giro passo 45 Å gruppi fosfato a zig-zag I residui pirimidinici (C,T) sono in anti quelli purinici(g, A) in syn

25 Z-DNA: Left-Handed Helix In A- e B-DNA, tutte le basi sono in anti In Z-DNA, pirimidine sono in anti, ma purine sono in sin.

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