Analisi denitrificazione del suolo. Dipartimento Biotecnologie Agrarie Università di Padova

Transcript

1 Agripolis

2 Analisi denitrificazione del suolo

3 Analisi denitrificazione del suolo

4 del suolo

5 del suolo

6 del suolo

7 del suolo Inoltre -Quantificazione CFU - Caratterizzazione molecolare CFU - Valutazione vitali - Valutazione metabolicamente attivi anche su campioni di acque

8 I siti di campionamenti acque sono tre: delle il fiume Zero (W1); la canaletta adacquatrice (W2) la scolina di drenaggio (W3). W2 W2 W3 W1 Per ogni stagione dell anno i campioni di suolo sono prelevati nella zona intermedia dell appezzamento A, in tre zone: prossimale,intermedia e distale rispetto alla canaletta adacquatrice (Ab1; Ab2; Ab3) a tre diverse profondità (S, M, D) S: strato superficiale 0-15 cm; M: strato intermedio cm; D: strato profondo cm Per ogni campione di suolo le analisi vengono ripetute in triplicato. In totale i campioni analizzati in un anno sono 108. Per ogni stagione dell anno e per ciascuna delle tre zone vengono effettuati tre campionamenti indipendenti (tre repliche). In totale i campioni analizzati in un anno saranno 36.

9 che vengono effettuate su ogni singolo campione Analisi Unità Formanti Colonia (CFU) Analisi della variabilità di popolazione batterica in relazione alle diverse fasi della catena di denitrificazione Conteggio dei batteri totali (vivi e morti) Conteggio batteri metabolicamente attivi Analisi morfologica dei batteri coltivabili Caratterizzazione molecolare della microflora batterica residente (DGGE) Caratterizzazione molecolare ARDRA dei batteri coltivabili

10 Isolamento CFU (Unità Formanti Colonie)

11 Conteggio dei batteri totali, vitali e non vitali (BacLight test) campione t.q. coltura liquida

12 Conteggio batteri metabolicamente attivi (CTC test)

13 il fiume Zero (W1); la canaletta adacquatrice (W2) la scolina di drenaggio (W3).

14 il fiume Zero (W1); la canaletta adacquatrice (W2) la scolina di drenaggio (W3).

15

16

17 campioni di Suolo

18 campioni di Suolo

19 campioni di Suolo

20 Campioni di Suolo: Ottobre Confronto Interno - Esterno La microflora è più attiva

21 analisi morfologica dei batteri coltivabili Isolamento singole colonie Osservazione diverse morfologie

22 biodiversità morfologica nei campioni di acqua Campione Fiume Zero (W1) Canaletta adacquatrice (W2) Scolina di drenaggio (W3) (W3) Fiume Zero (W1)

23 MARZO 2008: Acque analisi morfologica dei batteri coltivabili

24 LUGLIO 2008: Acque analisi morfologica dei batteri coltivabili

25 del suolo

26 MARZO 2008: Interno analisi morfologica dei batteri coltivabili

27 LUGLIO 2008: Interno analisi morfologica dei batteri coltivabili

28 OTTOBRE 2008: Esterno analisi morfologica dei batteri coltivabili

29 Caratterizzazione molecolare ARDRA dei batteri coltivabili Isolamento singole colonie Lisi delle singole colonie Amplificazione gene (16S) con i primer Hongoh (F63 R1389) Digestione con enzimi di restrizione (HinfI; HpaII) Elettroforesi su gel Analisi similarità dei profili con software GelCompar II

30 analisi ARDRA sui geni rdna 16 S..AATGTG A(N)TCGATCCT.

31 Analisi computer assistita tramite programma GelComparII le bande vengono definite...normalizzate... si crea infine una matrice di similarità, sulla base della quale viene costruito il dendrogramma

32 Analisi ARDRA (HinfI e HpaII) sui batteri coltivabili del Suolo Sono stati fino ad ora analizzati 600 campioni di suolo (+ 210 di acque) di cui si riportano 150 analisi totali (50 per ogni campionamento provenienti dalle tre profondità analizzate). Poiché ogni isolato è trattato con 2 enzimi di restrizione, il numero totale di profili è di 300.

33 Analisi ARDRA (HinfI e HpaII) sui batteri coltivabili del Suolo

34 Suolo MARZO: Analisi ARDRA (HinfI e HpaII) sui batteri coltivabili del Suolo From medium level From deep level From surface From surface

35 Suolo MARZO 2008: Analisi ARDRA (HinfI e HpaII) sui primi 50 amplificati rdna 16S relativi ai batteri coltivabili del Suolo S = superficiale M = intermedio D = profondo

36 Suolo LUGLIO 2008: Analisi ARDRA (HinfI e HpaII) sui primi 60 amplificati rdna 16S relativi ai batteri coltivabili del Suolo S = superficiale M = intermedio D = profondo

37 Estrazione DNA direttamente da suolo Dalle prove eseguite si è potuto notare che nei campioni vecchi non conservati a -20 il DNA è degradato: analisi ARDRA comparative (o meglio DGGE come previsto) tra campioni vecchi e nuovi NON SONO SIGNIFICATIVE. Questa è stata la ragione per cui sono stati analizzati campioni esterni che fungeranno da confronto non trattato.

38 Estrazione di DNA totale da 0,5 g di suolo, essiccato a temperatura ambiente, Mediante il Kit Power soil della MoBio DNA Marker 500 ng 250 ng 50 ng DNA Marker 500 ng 250 ng 50 ng Ottobre 1999 Ab2S Ab2 II Ab2 III Ab2S Ab2 II Ab2 III Ab3S Ab3 II Ab3 III Ottobre 2007 Ab2S Ab2 II Ab2 III Ottobre 2002 Marker Kb Ab3S Ab3 II Ab3III bp 1500 bp 1000 bp 500 bp Ab3S Ab3 II Ab3 III

39 Estrazione di DNA totale da 1 g di suolo, essiccato a temperatura ambiente, mediante il Kit Power soil della MoBio Ottobre 1999 Ottobre 2002 Ottobre 2007 DNA Marker 500 ng 250 ng 50 ng 25 ng 5 ng DNA Marker 500 ng 250 ng 50 ng 25 ng Ab2S Ab2 II Ab2 III Marzo ng Ab2S Ab2 II Ab2 III Ab2S Ab2 II Ab2 III Aprile 2008 Ab2S Ab2 II Ab2 III Ab2S Ab2 II Ab2 III Luglio 2008 Ab2S Ab2 II Ab2 III

40 Suolo OTTOBRE 2008: Analisi ARDRA (HinfI e HpaII) sui primi 50 amplificati rdna 16S relativi ai batteri coltivabili del Suolo ESTERNO S = superficiale M = intermedio D = profondo

41 Accorpamento/Confronto Vedi cartaceo.

42 SEQUENZIAMENTO NUCLEOTIDICO Dall osservazione del dendrogramma si sceglie un rappresentante per i gruppi più numerosi Per ciascuno di essi, si effettuerà il sequenziamento Le singole sequenze verranno confrontate con quelle disponibili in banca dati, in modo da ottenere l identificazione delle specie batteriche che compongono la comunità analizzata.

43 Estrazione DNA direttamente da suolo