Velocità di reazione

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2 Velocità di reazione A B V = - d[a] dt = d[b] dt V= Velocità istantanea: coefficiente angolare della retta tangente alla curva in quel punto Quando t=0 la velocità istantanea sarà massima (V 0 ) 2

3 Energia libera, G Urti molecolari e velocità di reazione (1) Teoria delle collisioni (Arrhenius, 1888) Es: A 2 B-B A A A A A 2 + B 2 + B 2 [A 2 B 2 ] Complesso attivato A 2 B 2 B B B B A B B A A A E a Energia di attivazione 2AB B A 2AB B A Ogni reazione chimica decorre attraverso la formazione di un Complesso attivato generato da un urto efficace Condizioni per un urto efficace : Sufficiente energia (almeno pari a E a ) Giusto orientamento (Effetto sterico) B A B A Coordinata di reazione 3

4 Urti molecolari e velocità di reazione (2) Effetto Sterico Es1: OH - + CH 3 Cl [OH CH 3 Cl] - CH 3 OH + Cl Sono efficaci soltanto gli urti nei quali lo ione ossidrile attacca l alogeno-derivato alchilico dal lato opposto a quello dove è legato l atomo di alogeno Es2: N 2 O + NO [N-N O N-O] # N 2 + NO 2 4

5 Urti molecolari e velocità di reazione (3) Energia di attivazione L energia di attivazione (Ea) corrisponde alla minima energia necessaria per un urto efficace Minore è il valore di Ea maggiore è il numero di molecole in grado di superare la barriera energetica e formare i prodotti La reazione anche se è termodinamicamente spontanea (DG r <0) potrebbe non avvenire se non attivata Spontaneità di reazione non vuol dire immediatezza C diamante O 2 g CO Molto 2 g Lenta DG o kJ H + + OH - H O aq aq 2 l Istantanea DG o 298 = -79 kj 5

6 Energia libera, G Urti molecolari e velocità di reazione (4) Energia di attivazione Es: 2H 2 + O 2 2 H 2 0 DG = Kcal/mol O - O A A H H O O H H E a La reazione da un punto di vista termodinamico è spontanea ma non avviene. Occorre una scintilla che innesca la reazione la quale poi continuerà a fornire l energia di attivazione necessaria perché altre molecole di H 2 e O 2 reagiscano H - H H-H DG r <0 H O H H O H Coordinata di reazione 6

7 Teoria delle Collisioni e Temperatura N E N N E =N e-ea /RT T1 < T2 < T3 T 1 Ea T 2 T3 Aumentando la temperatura, aumenta l energia cinetica media (E Cm ) delle molecole e di conseguenza aumenta il n di molecole (N E ) aventi l energia minima necessaria per formare il complesso attivato (Ea). Si può dimostrare (Arrhenius,1988) che a temperatura T, la frazione di molecole che hanno energia Ea è proporzionale a e -E*/RT (area colorata sotto la curva) E Cm1 E Cm2 E Cm3 Energia cinetica 7

8 Parametri che influenzano la velocità di reazione Secondo quanto detto sulla teoria delle collisioni è evidente che la velocità di una reazione chimica dipende da: Temperatura (energia cinetica) Energia di attivazione (barriera energetica) Fattore Sterico A (orientamento dell urto molecolare) k = A e -Ea/RT Costante cinetica Concentrazione dei reagenti (numero degli urti) V = k [Concentrazione] 8

9 Concentrazione e velocità di reazione aa + bb cc + dd V = k [A] m [B] n m,n : Ordine di reazione di un singolo reagente (si ricava solo sperimentalmente) m + n : Ordine di reazione complessivo Molecolarità : n di particelle (molecole, atomi, ioni) che urtano per dar luogo ad un singolo atto reattivo (reazione elementare) Es1: H 2 + I 2 2HI V=k[H 2 ][ I 2 ] 2 ordine, bimolecolare Es2: 2N 2 O 5 4NO 2 + O 2 V=k[N 2 O 5 ] 1 ordine Es3: 2NO+H 2 N 2 + 2H 2 O V=k[NO] 2 [H 2 ] 3 ordine, trimolecolare Es4: NO 2 +2HCl NO+H 2 O+Cl 2 V=k[NO][HCl] 2 ordine Solo nei processi elementari (Es1, 3) il coefficiente stechiometrico (a,b) coincide con l ordine di reazione (m,n) e con la molecolarità 9

10 Determinazione ordine di reazione (1) A + B C [A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,05 0,2 0,2 0,1 V = k [A] Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione è di 1 ordine, in quanto la sua velocità si dimezza quando viene dimezzata la concentrazione di A mentre non si raddoppia quando viene raddoppiata la concentrazione di B 10

11 Determinazione ordine di reazione (2) A + B C [A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,4 0,2 0,2 0,4 V = k [B] 2 Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione è di 2 ordine rispetto a B, in quanto la sua velocità è proporzionale alla seconda potenza della concentrazione di B e non varia al variare della concentrazione di A 11

12 Determinazione ordine di reazione (3) A + B C [A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,2 0,3 0,10 0,4 0,6 0,40 0,2 0,6 0,20 V = k [A] [B] Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione è di 2 ordine, in quanto la sua velocità si duplica sia quando viene raddoppiata la concentrazione di A che quando viene raddoppiata la concentrazione di B Si può anche dire che la reazione è di 1 ordine rispetto ad A e di 1 ordine rispetto a B 12

13 Determinazione ordine di reazione (4) In generale una reazione viene definita di 2 ordine se la sua velocità risulta sperimentalmente essere funzione lineare della concentrazione di un solo reagente elevata al quadrato o al prodotto delle concentrazioni di due reagenti. Quindi, la reazione è di secondo ordine se si verifica sperimentalmente uno dei casi seguenti: V = k [A] 2 V = k [B] 2 V = k [A][B] 13

14 Meccanismo di reazione Salvo rare eccezioni l equazione chimica rappresenta la somma di un certo numero di reazioni intermedie (Reazioni Elementari) da essa non desumibili La velocità di reazione è data dallo stadio lento (tappa limitante) Es: 2 ICl + H 2 2 HCl + I 2 V= k [ICl][H 2 ] La reazione è il risultato di due reazioni elementari ICl + H 2 HCl + HI Stadio lento V= k [ICl][H 2 ] ICl + HI HCl + I 2 Stadio veloce 2 ICl + H 2 2 HCl + I 2 V= k [ICl][H 2 ] HI = Intermedio di reazione 14

15 La tappa limitante nelle reazioni a più stadi Reagenti Intermedi Prodotti Stadio 1 Stadio 2 Rapido Lento Stadio limitante la velocità k A B C D F G H I La velocità totale del processo è uguale a quella della reazione più lenta (V= k[d]) Questo è spesso sfruttato negli organismi viventi per regolare il metabolismo 15

16 Energia libera, G L azione del catalizzatore (1) X + Y X-Y X + C X-C X-C + Y X-Y + C X + Y X-Y Reazione non catalizzata (Ea alta, V bassa) Reazioni in presenza di catalizzatore (C) (Ea bassa, V alta) C non si consuma perché riciclato Ea Ea C X Y X C+Y Il catalizzatore diminuisce Ea facendo percorrere alla reazione un cammino diverso senza variare il valore di DG Il catalizzatore non rende spontaneo un processo endoergonico X + Y DG X-Y coordinata di reazione 16

17 Es1: Esterificazione di un acido carbossilico H 3 C C O L azione del catalizzatore (2) OH H O CH 3 H 3 C C O OCH 3 H 2 O La reazione è lenta ma viene accelerata aggiungendo un acido inorganico alla miscela di reazione H 3 C C O OH H + OH + H 3 C C H 3 C OH + C OH OH H 3 C -C + H + OH H 3 C C OH OH OH H OH H O CH 3 H 3 C- C -O OH HOH O CH 3 H 3 C + C OH + CH 3 O CH 3 H + H H 3 C- H 3 C OH C- O-CH 3 OH C O O CH 3 17

18 L azione del catalizzatore (3) Es2: 2H H 2 O + O 2 DG = -50,2 Kcal/mol G Ea H Ea c DGr 2H 2 O+O 2 coordinata di reazione 1) H 2 O 2 +2Fe +2 +2H + 2H 2 O+2Fe +3 2) H 2 O 2 + 2Fe +3 O 2 +2H + +2Fe +2 2H 2 O Fe +2, H + 2 2H 2 O + O 2 Fe +2 e H + = catalizzatori Le bollicine di O 2 che si sviluppano quando si versa H 2 O 2 su una ferita sanguinante sono dovute all azione catalitica della catalasi, un enzima presente nel sangue 18

19 Catalisi omogenea Il catalizzatore e i reagenti sono nella stessa fase Es: 1)H 2 O 2 + I - H 2 O + IO - 2)H 2 O 2 + IO - H 2 O + O 2 + I - 2H 2 O 2 2H 2 O +O 2 19

20 Catalisi eterogenea Il catalizzatore e i reagenti NON sono nella stessa fase MnO Es1: 2H H 2 O + O 2 Es2: C x H y + a O 2 b CO 2 + c H 2 O 2 CO + O 2 2 CO 2 2 NO O 2 + N 2 2 NO 2 2 O 2 + N 2 Marmitta Catalitica Al 2 O 3 20

21 Equilibrio chimico e velocità di reazione (1) k 1 t=0 R P v v t=eq R k 1 k -1 k -1 P r s r v k 1 [ R] s v k r s v v 1[ P] k ] 1[ R] eq k 1[ P eq k1 [ P] k [ R] 1 eq eq Keq 21

22 Equilibrio chimico e velocità di reazione (2) In generale per una reazione reversibile: aa + bb + pp + qq + All equilibrio avremo: Keq k [P] [Q] = 1 p q = a b k- 1 [A] [B] Se l equazione è scritta nella forma inversa: pp + qq + aa + bb + K'eq = k k -1 1 = [A] [P] a p [B] [Q] b q da cui: K'eq = 1 Keq 22

23 Cinetica Enzimatica In vivo ogni reazione è catalizzata da un enzima specifico Enzimi: Proteina (PM ) Alto potere catalitico in condizioni blande di T, P e ph Elevata specificità e assenza di sottoprodotti Possibilità di regolazione fine Composizione CATENA POLIPEPTIDICA COFATTORE Apoenzima Oloenzima Coenzima o Gruppo prostetico (se legato covalentemente) 23

24 Gli enzimi sono classificati in base alle reazioni che catalizzano 24

25 Azione catalitica dell enzima (1) L aumento della velocità di reazione può variare di parecchi ordini di grandezza Es: Anidrasi carbonica 10 7 Fosfofruttomutasi Ureasi

26 Azione catalitica dell enzima (2) Effetto prossimità: l enzima facilita l urto efficace mediante un aiuto sterico 26

27 Azione catalitica dell enzima (3) Un esempio di Effetto di prossimità nelle razioni organiche 27

28 Azione catalitica dell enzima (4) Stereospecificità del sito catalitico 28

29 Azione catalitica dell enzima (5) Stiramento e/o distorsione del legame da rompere 29

30 Analisi equazione di Michaelis & Menten E + S k1 k-1 kcat ES P + E Km k 1 K m = K Kcat 1 k k 1 k v V 2 o max = = V K max m V K m [S] +[S] max [S] +[S] 2[S]= Km +[S] [S]= K m 30

31 Grafico dei doppi reciproci (Lineweaver & Burk) V o = V K max m [S] +[S] 1 v o = K V 1 V m max o + [S] [S] = = K V V m max K m max [S] 1 S + V + [S] [S] max 1 V [ ] max 31

32 Significato di Km (1) Es1: confronto dei valori di K m tra due enzimi con i relativi substrati Il valore di K m indica il grado di affinità di un enzima per un certo substrato Anidrasi carbonica 10 7 Fosfofruttomutasi Ureasi

33 Significato di Km (2) Es2: Confronto dei valori di K m della Esochinasi con due substrati diversi D-Glucosio (S 1 ) K m =0,05 D-Fruttosio (S 2 ) K m =1,5 La Km più alta riflette una minore affinità dell enzima per S 2 La Km più bassa riflette una maggiore affinità dell enzima per S 1 Minore è il valore di K m, maggiore è l affinità dell enzima per quel substrato 33

34 Significato di Km (3) Spiegazione alternativa K m K m k = = - k k k k1 cat = K s k1 E + S ES P + E k-1 k cat se k cat <<k -1 (ipotesi quasi sempre verificata) avremo: Costante di Dissociazione del Complesso ES ES k-1 k1 E + S k - 1 K s = = k1 [E][S] [ES] [ES] Alta K s bassa Alta Affinità 34

35 V 0 Significato di Vmax V 0 = k cat [ES] [E T ] = [E] + [ES] V max = k cat [E T ] Vmax 3 Vmax 2 Vmax 1 [E 3 ]>[E 2 ]>[E 1 ] [S] Vmax è una misura della concentrazione enzimatica e si esprime in Unità Internazionali (U) 1U= Quantità di enzima che catalizza la formazione di 1mM di prodotto per min in condizioni definite (ph, T,...) Kcat Conoscendo [E T ] e V max si può calcolare K cat = V [E max T ] Costante catalitica o Numero di turnover (mm di substrato trasformate per min) 35

36 Effetto del ph sulla stabilità e attività dell enzima S E ES P E S H + S E E OH - ES ES 36

37 Effetto della Temperatura sulla stabilità e attività dell enzima Risultato di due processi concorrenti: Aumento di V 0 all aumentare di T k = A e -Ea/RT (vedi teoria degli urti di Arrenius) T ottimale Diminuzione di V 0 a temperature superiori a quella ottimale per la rottura di legami deboli della struttura terziaria della catena polipeptidica della proteina (vedi denaturazione delle proteine) 37

38 Inibizione enzimatica L inibizione (Reversibile o Irreversibile) è uno dei maggiori sistemi di regolazione del metabolismo Inibizione Irreversibile E + S k1 k-1 kcat ES P + E + I EI Complesso abortivo irreversibile K m = V max Es: Inibizione dell Acetilcolinesterasi con il gas nervino Diisopropilfluorofosfato (DIFP) ( Inibitore suicida vedi anche 5F-U) E.. O CH 3 CH 2 -OH + F-P-O-CH E O CH 3 CH 2 -O -P-O-CH + HF Acetilcolinesterasi (degrada l acetilcolina) O CH 3 H 3 C-CH-CH 3 O CH 3 H 3 C-CH-CH 3 38

39 Inibizione Competitiva (IC) Km app v o = K m V m ax ( [ I] 1+ ) + [S] Ki [S] V max = Km app 1 v o = K V m m ax ( [ ]) 1 1+ I + Ki [S] 1 V m ax 39

40 Inibizione Competitiva (2) Es1: Antimetaboliti (sulfamidici, pro-farmaci analoghi di basi e nucleosidi purinici e pirimidinici) NH 2 COOH NH 2 O=S=O H N R Parte essenziale per l attività Acido p-aminobenzoico Diidrofolato Sintetasi (Solo batterica) R=H: Sulfanilamide Antagonizza l incorporazione dell acido p-aminobenzoico nell acido folico dump Timidilato Sintetasi dtmp Acido Folico DNA Negli animali non esiste la diidrofolato reduttasi. L acido folico deve essere assunto dalla dieta (vitamina) 40

41 Inibizione Competitiva (3) Es2: Analogo non metabolizzabile COO - CH 2 CH 2 COO - Succinato COO - CH 2 COO - Malonato Fumarato E-FAD E-FADH 2 Succinico deidrogenasi COO - CH HC COO - )+ Sito attivo ) + 41

42 Inibizione Competitiva (4) Es3: Analogo metabolizzabile H H H C-C-O-H H H Etanolo NAD NADH + H + H H C-C=O H H Acetaldeide H H C-O-H H Metanolo Alcool deidrogenasi H C=O H Formaldeide Idrossimetila proteine e acidi nucleici 30 ml di metanolo sono letali 42

43 Inibizione Non Competitiva (INC) V o = V m ax [I] 1+ Ki K m [S] +[S] V max K m = 1 v o = K V m m ax ( ) ( ) [I] [I] Ki 1 + [S] 1 V m ax Ki 43

44 Inibizione Incompetitiva (IIC) V max Km app V o = V K m ax [I] 1+ Ki m [I] 1+ Ki [S] +[S] 1 v o = K V m m ax 1 [ S] + 1 V m ax ( [ I ]) 1+ ki 44

45 Schema riassuntivo dei grafici dei doppi reciproci IC, INC, IIC Vmax Km app 1 Km 1 [ I ] 1 v o Vmax Vmax Ki 45

46 Enzimi oligomerici Km K0.5 Macromolecole proteiche a più subunità (monomeri o protomeri) Se i siti catalitici sono indipendenti (non cooperativi) avremo enzimi con cinetica classica Micheliana (V 0 /[S] curva iperbolica) Se i siti sono dipendenti (cooperativi) avremo enzimi allosterici (V 0 /[S] curva sigmoide) 46

47 Enzimi allosterici L interazione (binding) di una molecola di legando (substrato, inibitore, attivatore) con un sito catalitico di una subunità, modifica il binding, aumentando o diminuendo l affinità degli altri siti liberi Interazioni omotropiche:stesso legando (substrato) Interazioni eterotropiche:legandi diversi (substrato,inibitore,attivatore) 47

48 Regolazione degli enzimi allosterici (1) Interazioni Omotropiche C C - S S + ½ V max V 0 S C C S K 0.5 [S] S C C S 48

49 Regolazione degli enzimi allosterici (2) Interazioni Eterotropiche Substrato Modulatore positivo(attivatore) Modulatore negativo (Inibitore) S S C R - + S C R 49

50 Due possibili modulazioni allosteriche Vmax K 0.5 = Vmax = K

51 Enzimi allosterici: chiave di controllo nella regolazione metabolica Gli enzimi allosterici si trovano spesso in punti strategici delle vie metaboliche ed agiscono con effetto switch on-off 51