Ag multivalenti o polivalenti

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1 ANTIGENE (Ag)= qualsiasi sostanza capace di legarsi in modo specifico ad un anticorpo (Ab) o al TCR Tutti gli antigeni sono riconosciuti dai linfociti o da anticorpi specifici. Peptidi Zuccheri Lipidi Acidi nucleici Ciascun anticorpo si lega solo ad una porzione delle macromolecole definita determinante antigenico o epitopo Ag multivalenti o polivalenti Ag POLIVALENTI hanno lo stesso epitopo ripetuto per es. acidi nucleici, zuccheri

2 Antigeni Completi ed incompleti (apteni) APTENI = Composti chimici di piccole dimensioni che si legano agli anticorpi ma non provocano una risposta immunitaria Per essere immunogeni devono essere coniugati con macromolecole CARRIER

3 DETERMINANTE ANTIGENICO o EPITOPO (6 AA) = parte dell Ag che si lega all Ab (1 Ag ha più epitopi quindi può legare più Ab); epitopo può essere lineare o conformazionale

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5 K d Legame ionico Riconoscimento Ag-Ab è dato da interazioni NON covalenti e REVERSIBILI Affinità somma forze attrattive e repulsive singolo sito di legame e singolo epitopo

6 Costante di associazione = misura di affinità 1 angstrom (1x10-7 mm) Ag+Ab k1 k2 Ab-Ag Legge di azione di massa Ka= [Ab-Ag]/ [Ab][Ag] Ka=K1/K2 Ka bassa affinità= L/mol Kd=[Ag][Ab]/[Ag-Ab] Ka alta affinità=10 11 L/mol K d

7 DIALISI ALL EQUILIBRIO Misuro l affinità di un anticorpo per l antigene (Ka) 1000 dal Per valutare l affinità di un Ab per un Ag DIFFUSIBILE si usa il metodo della DIALISI ALL EQUILIBRIO

8 Raggio di luce polarizzata Ru= Unità di risonanza

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10 Avidità = forza complessiva di interazione tra un Ab multivalente e l Ag polivalente, tiene conto delle affinità dei singoli siti di interazione e della quantità di siti di interazione presenti sull Ab per l Ag

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12 Reazione Ag-Ab in vitro è una reazione di tipo visibile che si distingue in reazione di precipitazione quando l antigene è solubile reazione di agglutinazione quando l antigene è corpuscolato.

13 Reazione di Precipitazione: Se in soluzione si aggiungono Ag e Ab specifici per quell Ag, le due molecole si associano formando un precipitato=immunocomplesso Antigene aggiunto Se la reazione avviene in gel di agarosio si vedranno gli aloni di precipitazione

14 NEFELOMETRIA Ex: misurare IgG nel siero La presenza di piccoli aggregati che si ottengono quando soluzioni diluite di mab-ag formano una soluzione torbida che può essere misurata Laser luce monocromatica Possono essere misurati campioni molto piccoli 1-10µl Ex Immunoglobuline, C3, C4, aptoglobina, ceruloplasmina, CRP l'assorbimento/diffusione

15 Serve per misurare la concentrazione di un Ag Ex IgG nel siero Secondo Mancini-Carbonara- Heremans

16 Immunoelettroforesi Ex applicazione: diagnosi mieloma multiplo (IgG, IgA, IgD o IgE) o Macroglobulinemia di Waldenstrom (IgM) Ab di capra anti siero umano totale

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18 Reazione di_agglutinazione: quando l Ag è corpuscolato: 1- GLOBULI ROSSI 2- BATTERI 3- PARTICELLE DI LATTICE CON Ab anti-ormoni Ab Ag Mezzo ambiente Potenziale z

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20 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Sfrutta il legame diretto dell Ab con l Ag Sono necessari: Ab puro Ag puro (per curva standard di riferimento)

21 RIA (Radio Immuno Assay) L Ab o l Ag sono marcati con isotopo radioattivo (solitamente 125 I)

22 Determinazione dei risultati di un paziente attraverso una curva di fit segnale... Curva Standard Campione X... Concentrazione

23 ELISA o RIA sandwich

24 Metodo di conteggio, selezione ed isolamento di particelle (cellule)

25 Le cellule vengono marcate con Ab coniugati con un fluorocromo e diluite in un volume maggiore di soluzione salina che passa attraverso un capillare di modo che le cellule passino una alla volta. La vibrazione determina la rottura in gocce della colonna liquida contenente le cellule Ogni goccia deve contenere 1 cellula Ogni cellula che passa attraverso il raggio laser riflette il raggio, i fluorocromi si eccitano ed emettono fluorescenza. Un tubo fotomoltiplicatore rileva la luce riflessa (informazioni su grandezza e granulosità) e la fluorescenza.

26 Per separare le cellule (FACS= Fluorescent- Activated Cell Sorter) il segnale torna al computer che genera una carica elettrica sulla goccia contenente la cellula singola, poi un campo magnetico determina la direzione per la raccolta.

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28 Questa tecnica permette di stabilire se gli antigeni depositati nei diversi pozzetti sono o non sono identici o se hanno epitopi in comune