Scientists with lab coats: Corso di laboratorio Chimico-Biologico. Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona

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1 Scientists with lab coats: Corso di laboratorio Chimico-Biologico Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona

2 Il DNA Il DNA contiene l informazione genetica di un organismo Scritta in un codice chimico basato su 4 «lettere»: A, T, C, G Le 4 lettere si chiamano nucleotidi, che sono uguali in tutti gli organismi che contengono il DNA Nella cellula, il DNA viene «letto» e trascritto in RNA, una struttura simile al DNA L RNA viene tradotto in strutture diverse, dette amminoacidi I 20 amminoacidi sono uniti in sequenza, formando una proteina Diverse combinazioni dei 20 amminoacidi danno forma a diverse proteine DNA RNA proteine Dogma centrale

3 Com è fatto il DNA Basi 1 base + 1 gruppo fosfato + 1 zucchero = nucleotide Gruppo fosfato Zucchero Gruppo fosfato Base Adenina Nucleotide Adenosina zucchero Zucchero Timina Timidina fosfato Citosina Citidina base nucleotide Guanina Guanosina

4 Com è fatto il DNA E composto da nucleotidi Nucleotide: Zucchero Base Gruppo fosfato Base: Adenina Guanina Citosina Timidina Uracile (RNA) Zucchero: Deossiribosio Ribosio (RNA)

5 Com è fatto il DNA Basi: purine o pirimidine

6 Il DNA fosfato zucchero I nucleotidi Due filamenti si legano tra loro base (guanina) nucleotide Il DNA è un polimero di nucleotidi Si uniscono tra loro formando un filamento I nucleotidi sono monomeri Il DNA è un polimero (composto da diversi monomeri)

7 Il DNA Più da vicino... Adenosina e Guanosina (purine) Timidina e Citidina (pirimidine) Le varie componenti sono legate tra di loro da legami covalenti I legami coinvolgono l atomo di carbonio in 3 e l atomo di carbonio in 5 dello zucchero La sequenza dei nucleotidi nel filamento di DNA si «legge» sempre dall estremità 5 all estremità 3

8 Il DNA Orientati in senso opposto = Antiparalleli Legami idrogeno tra le basi di due filamenti I due filamenti si attorcigliano su loro stessi a formare una doppia elica

9 Il codice genetico 4 nucleotidi 20 amminoacidi il codice genetico migliaia di proteine Il DNA deve essere accessibile all occorrenza Quando una cellula si duplica il DNA deve essere - duplicato - suddiviso (correttamente) tra le due cellule

10 Il codice genetico L intero genoma umano è lungo circa 2 m Il nucleo di una cellula umana ha un diametro di 5-8 um 1 cm 1 cm / 10 1 mm 1 mm / um

11 I cromosomi Il DNA viene «ripiegato» da proteine specifiche, in modo da occupare meno spazio Le strutture che si vengono a formare si chiamano cromosomi

12 I cromosomi DNA + istoni + proteine non istoniche = cromatina DNA nucleosoma cromatina nucleosoma = 8 proteine istoniche (2 H2A + 2 H2B + 2 H3 + 2 H4) DNA lungo 147 nucleotidi

13 I cromosomi da cromatina fibra di cromatina = cromatina + istone H1 cromatina fibra di cromatina istone H1 modifica l inclinazione del filamento di DNA appena esce dal nucleosoma permette la formazione di una fibra di cromatina più compatta

14 I cromosomi la fibra di cromatina è avvolta in una serie di anse (loops) meccanismi non ancora identificati i loops vengono ulteriormente compattati per formare i cromosomi ogni molecola di DNA diventa un cromosoma volte più piccolo della molecola di partenza

15 La replicazione i cromosomi si estendono nel nucleo come sottili filamenti di DNA ogni cromosoma viene duplicato i cromosomi vengono segregati tra le due cellule 1 copia/cellula ritorno allo stato di cromosomi estesi

16 La replicazione 1 cromosoma duplicazione 2 cromosomi 1 cromosoma/cellula fuso mitotico

17 La replicazione cromosomi in mitosi (compatti) cromosomi in interfase (estesi)

18 Replicazione del DNA Ad ogni divisione cellulare, una cellula deve copiare (con precisione) tutto il corredo genetico DNA: 2 filamenti, uno complementare all altro 2 stampi Replicazione semiconservativa vecchio nuovo nuovo vecchio

19 Replicazione del DNA I due filamenti della doppia elica sono tenuti insieme da legami idrogeno Servirebbe una temperatura vicina ai 100 C per ottenere sufficiente energia per spezzare i legami e separare i due filamenti di DNA Proteine iniziatrici legano regioni specifiche del DNA, le origini di replicazione Le proteine iniziatrici rompono i legami idrogeno tra le basi

20 Replicazione del DNA Il genoma umano è molto lungo La replicazione inizia contemporaneamente in circa origini di replicazione Ad ogni origine di replicazione si formano 2 biforcazioni La replicazione del DNA procede in direzioni opposte bidirezionale

21 Replicazione del DNA Nuovi nucleotidi vengono aggiunti uno ad uno, formando il nuovo filamento (new strand). Ogni nucleotide aggiunto deve essere complementare al nucleotide presente nel filamento stampo (template strand). L aggiunta dei nuovi nucleotidi avviene ad opera di un enzima: la DNA polimerasi.

22 Replicazione del DNA La DNA polimerasi è precisa: 1 errore di accoppiamento tra le basi ogni di nucleotidi aggiunti proofreading Nucleotidi errato Rimozione del nucleotide Aggiunta del nucleotide corretto La DNA polimerasi aggiunge i nuovi nucleotidi nel sito di polimerizzazione P Controlla e rimuove i nucleotidi nel sito di editing E

23 Replicazione del DNA Conseguenze di mutazioni: Anemia falciforme La funzionalità di una proteina è determinata dalla sequenza di amminoacidi che la compongono La sequenza di amminoacidi è determinata dalla sequenza di nucleotidi nel DNA La mutazione di 1 nucleotide può cambiare 1 amminoacido nella proteina Può alterarne la funzionalità L emoglobina trasporta l ossigeno nel sangue La mutazione rende l emoglobina meno solubile forma aggregati i globuli rossi cambiano forma e diventano più fragili debolezza, capogiri, mal di testa i globuli rossi aggregati possono bloccare i vasi l afflusso di sangue La mutazione provoca uno svantaggio Ma aumenta la resistenza alla malaria!

24 Replicazione del DNA La replicazione del DNA inizia in diversi punti Serve un segnale di inizio per l inizio della replicazione: un primer L enzima primasi, cioè un RNA polimerasi, sintetizza un piccolo frammento di RNA complementare allo stampo DNA La DNA polimerasi comincerà la sintesi del nuovo filamento da quel primer

25 Replicazione del DNA Origine di replicazione 2 Origine di replicazione 1 La replicazione del DNA inizia in diversi punti Primer di RNA Nuovo filamento di DNA DNA polimerasi DNA polimerasi La DNA polimerasi raggiunge il primer dell origine di replicazione seguente Nucleasi DNA polimerasi Polimerasi di riparazione Una nucleasi degrada il primer di RNA Una polimerasi di riparazione aggiunge i nucleotidi di DNA DNA ligasi Una DNA ligasi unisce i frammenti di DNA

26 Replicazione del DNA I due filamenti di DNA sono antiparalleli Le DNA polimerasi avanzano lungo i filamenti in direzioni opposte Il DNA è composto da due filamenti separati Quando la nucleasi degrada il primer di DNA, rimane un «buco» La fine dei filamenti di DNA (la fine dei cromosomi) è diversa dal resto della molecola di DNA Non contiene sequenze che verranno tradotte in proteine, ma sequenze ripetute di nucleotidi I telomeri

27 Replicazione del DNA Fine del cromosoma La telomerasi si lega al filamento stampo Aggiunge sequenze ripetute allunga il filamento stampo Una DNA polimerasi può legarsi e sintetizzare il frammento di DNA mancante

28 Come «vedere» il DNA: la PCR PCR = Polymerase Chain Reaction (reazione a catena della polimerasi) da 1 filamento di DNA miliardi di copie in poche ore Necessari: Campione di DNA 2 primers (sequenze complementari alla regione che vogliamo amplificare, 1 primer/filamento DNA polimerasi Nucleotidi (A, T, C, G) Buffer Acqua Termociclatore

29 Come «vedere» il DNA: la PCR Le varie componenti sono legate tra di loro da diversi tipi di legame - legami covalenti - legami idrogeno

30 Come «vedere» il DNA: la PCR Temp Ambiente 90 C Temp Ambiente 90 C raffreddamento Doppia elica Singoli filamenti Doppia elica

31 Come «vedere» il DNA: la PCR 90 C raffreddamento Denaturazione Doppia elica Singoli filamenti Doppia elica DNA denaturato Rinaturazione Ibridizzazione DNA rinaturato Frammenti di DNA complementari ad una regione specifica del genoma Ibridizzazione

32 Come «vedere» il DNA: la PCR Replicazione Primer DNA polimerasi DNA polimerasi DNA polimerasi DNA polimerasi DNA polimerasi

33 Come «vedere» il DNA: la PCR Campione di DNA Soluzione Termociclatore 2 primers Nucleotidi (A, T, C, G) DNA polimerasi Denaturazione Rinaturazione Sintesi del DNA 1 ciclo di PCR 1 copia di DNA 2 copie di DNA

34 Come «vedere» il DNA: la PCR 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo La reazione è esponenziale: dopo 30 cicli di PCR si ottengono ~ di copie della sequenza di DNA di interesse

35 A cosa serve la PCR Diagnosi di malattie

36 A cosa serve la PCR Diagnosi di malattie e valutazione dell efficacia terapeutica

37 Come «vedere» il DNA La fluorescenza emessa dal SYBR GREEN è proporzionale al numero di molecole di DNA presenti ad ogni ciclo La reazione si ferma, si arriva al plateau Cindy J. Smith, A. Mark Osborn. FEMS Microbiol Ecol (2009) 67 (1): 6-20.

38 Fluorescenza Come «vedere» il DNA più copie meno copie numero di cicli di PCR

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