IMMUNOFENOTIPO Citometria a flusso

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1 IMMUNOFENOTIPO Citometria a flusso Identificazione popolazione cellulare ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico liquor, versamenti Caratterizzazione popolazione cellulare linea di appartenenza stadio di differenziazione asincronia maturativa presenza di aberrazioni antigeniche Quantificazione Intensita di espressione di un determinato Ag sulla cellula (MIF e ABC) L esecuzione di una corretta analisi citofluorimetrica su popolazioni neoplastiche NON PUO PRESCINDERE DALLA CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE della popolazione da esaminare e dal sospetto diagnostico

2 IMMUNOFENOTIPO Citometria Vs Citometria a flusso Citometria e possibile localizzare un antigene scarsa capacita di analizzare piu parametri scarsa capacita di valutare i diversi sottotipi cellulari valutazione morfologica quantitativa e qualitativa Citometria a flusso e possibile analizzare moltissime cellule in un tempo breve capacita di analizzare piu parametri approccio multiparametrico quantitativo e qualitativo

3 Citofluorimetria: definizione Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule in sospensione all interno di un fluido di trasporto FLUIDICA OTTICA cellule in sospensione passano in singola fila attraverso un volume illuminato dove esse riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale ELETTRONICA che viene inviato al compiuter

4 Camera di flusso (componente fluida)

5 Citofluorimetro: principi

6 Citofluorimetro: principi

7 SPETTRI DI FLUOROCROMI

8 Analisi citofluorimetrica

9 Perche si guarda FSC Vs SSC Dato che FSC dimensione cellulare e SSC struttura interna, la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule

10 ESEMPIO DI CITOGRAMMA NORMALE NORMALE: IL CD45 CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

11 CD45: citogramma di un midollo normale Perche si guarda CD45 Vs SSC Dato che SSC dimensione cellulare e CD45 pan leucocitario la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule 1-LYMPH 2-MONO 3-GRAN 4-BLAST 5-ERY

12 CD45 Maturazione mieloide: SIDE SCATTER Normale Aberrante SSC

13 CITOGRAMMA NORMALE ESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA) CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

14 ESEMPIO DI CITOGRAMMA NORMALE PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA) CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

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16 STEM CELL CD117 HLA-DR CD90 TdT CD38 Lymphoid progenitor B-progenitor CD19 CD10 CD34+/- CD22 ccd79a TdT CD38 scd22 CD24 B lymphocite CD34- CD34+ ccd79a CD19 CD20 CD22 scd79b FMC-7 CD38 sigm Ig kappa Ig lambda Cortical thymocyte ccd3 CD1a CD34- CD2 CD5 CD7 CD4 CD8 CD38 T lymphocite CD34- scd3 CD7 CD2 CD5 CD4 CD8 TCR a/b TCR g/d CD34+ CD117 HLA-DR CD90 CD38 CFU-GM CD34+ Myeloblast CD34- CD33 CD13 CD13 CD33 CD15 CD14 CD11b Myeloid progenitor CD34+ CFU-MK CD34- MPO CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 BFU-E/CFU-E CD61 CD41 CD42a CD34- CD36 CD71 Gli-A

17 MATURAZIONE LINFOIDE B

18 MATURAZIONE LINFOIDE T

19 Schema di differenziazione delle cellule B normali

20 Schema di differenziazione delle cellule B normali Sangue midollare da donatore sano Vs LAL B

21 SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE B Marcatori B-lineage SUPERFICIE

22 CD3 CD8 CD3 CD3 CD8 CD3 Schema di differenziazione delle cellule T normali Il concetto EMPTY SPACES CD5 CD4 CD2 CD5 CD4 CD2

23 SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE T Marcatori T-lineage SUPERFICIE

24 IMMUNOFENOTIPO Utilizzo di 6-8 colori per la identificazione di antigeni di superficie, citoplasmatici e nucleari; possibilita di studiare qualsiasi sospensione cellulare Identificazione dei leukemia-associated Phenotypes (LAIP) Firma fenotipica paziente-specifica Utilizzo delle aberrazioni specifiche sia per la diagnosi che per lo studio della Malattia Minima Residua

25 IMMUNOFENOTIPO Permette di IDENTIFICARE,QUANTIFICARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti (linea di appartenza, stadio di differenziazione, presenza di aberrazioni, intensita di espressione antigenica MIF e ABC) In caso di antigeni specifici l immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima Marcatori cellulari: la nomenclatura CD Si considera membro di un Cluster Differentiation un marcatore di superficie che: identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo ha una struttura biochimica definita è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

26 ESPRESSIONE DI UN ANTIGENE MIF (Mean Fluorescence Intensity) FL2-H FL2-H FL2-H MIF La Mean Intensity Fluorescence è un valore fornito dal citofluorimetro e rappresenta il rapporto tra la fluorescenza del campione e quella dell isotipo; e proporzionale ai siti di legame MIF= intensita media M2/intensita media M1 ABC (Antibody Binding Capacity) ABC Antibodies Bound per Cell è un valore che si ottiene confrontando l espressione di un antigene con una curva di riferimento costruita con rapporti noti tra molecole di antigene/valore di fluorescenza Area di calcolo

27 Studio citofluorimetrico della MMR C OSA si va a cercare? Assetti immunofenotipici leucemia-associati Espressione Ag ectopica : es. blasti di LAL-T a livello midollare, blasti TdT + a livello extra-midollare Ag aberranti: es. blasti di LAL della linea B con Ag T o mieloidi; blasti di LMA con Ag T o B Espressione Ag asincrona: es. CD19/CD34/TdT/cyt.m in LAL B, CD34/CD56 o CD15 in LAM Diversa entità di espressione Ag: es CD10, CD19, TdT in LAL B

28 Metodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie Acute 10 0 Morphology 10-1 Cytogenetic Southern blot FISH 10-4 Flow cytometry PCR 10-7 Con le tecniche convenzionali di citomorfologia è possibile identificare l'1-5% di popolazione di cellule normali cellule leucemiche in una La sensibilità aumenta in modo significativo (fino a 10-4) quando vengono applicate tecniche immunologiche utilizzando anticorpi diretti contro antigeni di differenziazione delle serie linfoide ed enzimi selettivamente espressi negli stadi più precoci dell'ontogenesi Grazie alla combinazione di tre metodologie (biologia molecolare, cariotipo, FCM) tutti i pazienti possono essere stratificati in più gruppi di rischio appropriato per la ripartizione terapia basata sul rischio

29 Misura della fluorescenza: utilità Le cellule possono essere identificate grazie alle loro molecole di superficie e relativo specifico marker (CD, cluster di differenziazione ) Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono essere utilizzati per identificare il tipo di cellula L anticorpo monoclonale può essere coniugato con un Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5 ) e si può eseguire un test di immunofluorescenza diretta

30 STEM CELL CD117 HLA-DR CD90 TdT CD38 Lymphoid progenitor CD34+ CD34+ CD117 HLA-DR CD90 CD38 Myeloid progenitor CD34+ MPO CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 CFU-GM CD34+ CD33 CD13 CFU-MK BFU-E/CFU-E CD34- CD36 CD71 Gli-A Myeloblast CD34- CD13 CD33 CD15 CD14 CD11b CD34- CD61 CD41 CD42a

31 Modificazioni fenotipiche durante la normale differenziazione neutrofila Mieloblasti Promielociti Mielociti Metamielociti Neutrofili CD15 CD13 CD64 MPO CD CD33 CD65 CD CD11b 10 1 CD1 6 CD10 CD34 HLA-DR CD117 CD54

32 SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE la granulopoiesi

33 SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE la monocitopiesi

34 Maturazione mieloide I II III IV V Myelo/monoblast CD34 CD117 HLA-DR CD13++ CD33++ Promyelocyte CD117 CD13++ CD33++ CD15 Myelocyte CD13 dim CD13 dim CD15 CD11b* Metamyelocyte Band cell CD13 CD33 dim CD15 CD11b CD16* Neutrophil CD13++ CD33 CD15 CD11b++ CD16++ CD45** CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD16/CD13/CD45/CD11b CD15/CD11b/CD45/CD33

35 Adherence to Fibrinogen, Chemotaxis Maturazione mieloide C D 11 b CD16 Neutrofilo CD16/CD11b/CD45/CD34

36 Maturazione mieloide

37 STEM CELL CD117 HLA-DR CD90 TdT CD38 Lymphoid progenitor B-progenitor CD19 CD10 CD34+/- CD22 ccd79a TdT CD38 scd22 CD24 B lymphocite CD34- CD34+ ccd79a CD19 CD20 CD22 scd79b FMC-7 CD38 sigm Ig kappa Ig lambda Cortical thymocyte ccd3 CD1a CD34- CD2 CD5 CD7 CD4 CD8 CD38 T lymphocite CD34- scd3 CD7 CD2 CD5 CD4 CD8 TCR a/b TCR g/d CD34+ CD117 HLA-DR CD90 CD38 CFU-GM CD34+ Myeloblast CD34- CD33 CD13 CD13 CD33 CD15 CD14 CD11b Myeloid progenitor CD34+ CFU-MK CD34- MPO CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 BFU-E/CFU-E CD61 CD41 CD42a CD34- CD36 CD71 Gli-A

38 CD34 G ate Totale C D34 pos/c D45 pos =0.58% Midollo donatore sano G ate Totale C D34 pos/c D45 pos =0.7% Aferesi donatore sano

39 G ate Totale C D34 pos/c D45 pos =0.3% Sangue cordone ombelicale