Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni

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1 Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Preparazione dei campioni: (Estrazione del DNA o dell RNA dal tessuto di interesse) Analisi delle mutazioni: SSCP DHPLC Dot blot - Southern - PCR (ARMS Enzimi di restrizione) Real-Time PCR (Discriminazione allelica) - RT-PCR Analisi HT

2 Examples of Inherited Disorders Detectable by PCR Disease Affected Gene Severe-combined immunodeficiency, SCID adenosine deaminase (ADA) Lesch-Nyhan syndrome hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) α 1 -Antitrypsin deficiency α 1 -Antitrypsin Cystic fibrosis cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR) protein Fabry disease α-galactosidase Gaucher disease acid β-glucosidase (glucocerebrosidase) Sandhoff disease hexosaminidase A and B Tay-Sachs disease hexosaminidase A Familial hypercholesterolemia (FH) LDL receptor Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency glucose-6-phosphate dehydrogenase Maple syrup urine disease branched-chain α-keto acid dehydrogenase Phenylketonuria (PKU) phenylalanine hydroxylase Ornithine transcarbamylase deficiency ornithine transcarbamylase Retinoblastoma (Rb) RB gene product, prb Sickle-cell anemia point mutation in β-globin β-thalassemia mutations in β-globin gene that result in loss of synthesis of protein Hemophilia A Factor VIII Hemophilia B Factor IX

3 Diagnosi attraverso l analisi molecolare mrna DNA

4 Diagnosi attraverso l analisi molecolare mrna a. RT-PCR b. Protein Truncation Test (PTT)

5 a. RT-PCR RT-PCR permette di evidenziare variazioni nella lunghezza dell mrna (delezioni) oppure modulazioni del livello dei trascritti (mutazioni nei siti di regolazione dell espressione). Può essere vantaggiosa nel caso si analizzi un gene di notevoli dimensioni (distrofina).

6 The dystrophin gene is the largest gene found in nature, measuring 2.4 Mb. 79 exons

7 L analisi viene condotta operando inizialmente una reazione enzimatica di amplificazione del DNA, conosciuta come Polymerase Chain Reaction (PCR), che consente di amplificare in vitro una specifica regione della molecola, copiandola in varie fasi successive, fino ad ottenerne milioni di copie. In tale maniera vengono amplificati, mediante amplificazione genica fluorescente multipla, 18 esoni del gene della Distrofina, così ripartiti: Il sistema, realizzato seguendo le linee guida del gruppo collaborativo europeo per la diagnosi molecolare della Distrofia DMB/DMD (EMQN), permette di evidenziare circa il 98% delle delezioni del gene della Distrofina. Exon Size DYE Exon Size DYE (bp) (bp) exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM

8 b. Protein Truncation Test (PTT) Il PTT è un test che permette di mettere in evidenza la formazione di una proteina tronca. Naturalmente non permetterà di conoscere il tipo di mutazione che ha causato l evento

9 PTT Protein Truncation Test È un test specifico per mutazioni frameshift, nonsense, splice site che portano alla produzione di una proteina tronca (Neurofibromatosi, Distrofia di Duchenne)

10 Amplificazione del cdna Presenza al 5 : di un promotore, sito di inizio della trascrizione Una sequenza specifica che permetta il giusto frame di lettura Il prodotto di PCR viene messo in contatto con un sistema di trascrizione e traduzione che costruisce il polipeptide corrispondente, le cui dimensioni vengono analizzate su gel di poliacrilamide con SDS. Polipeptidi tronchi avranno dimensioni minori rispetto a quelle di controllo.

11 Diagnosi attraverso l analisi molecolare DNA a. Mutazioni non necessariamente caratterizzate b. Specifiche mutazioni

12 Amplificazione della sequenza da analizzare (PCR) Individuazione dei prodotti mediante sonde specifiche (Ibridazione)

13 a. Mutazioni non necessariamente caratterizzate Mobilità elettroforetica di heteroduplex Single-strand conformation polymorphism (SSCP) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Mismatch cleavage enzimatico chimico

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17 SSCP Analisi di polimorfismi di DNA a singola elica Amplificazione mediante PCR del frammento di DNA da analizzare. Denaturazione. Elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante del DNA da analizzare e di un DNA di controllo.

18 In presenza di mutazione la diversità di conformazione del DNA a singola elica determinerà differenze nella velocità di migrazione.

19 DGGE denaturing gradient gel electrophoresis DHPLC denaturing high performance liquid cromatography Sfruttano le proprietà del DNA eteroduplex, in gradiente di denaturazione, per poter individuare sequenze che differiscono anche per una sola base

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21 Questi metodi non individuano la posizione e il tipo di mutazione. Non permettono di discriminare tra una mutazione che provoca un alterazione nel prodotto proteico ed un semplice polimorfismo del DNA.

22 Per conoscere quindi se la mutazione messa in evidenza può causare un fenotipo patologico occorre ricorrere al sequenziamento

23 b. Specifiche mutazioni La mutazione che causa la malattia è unica ( Falcemia ) Effetto del fondatore o vantaggio degli eterozigoti ( βtalassemia Fibrosi cistica ) La malattia è causata da uno specifico meccanismo molecolare ( Corea di Huntington FraX )

24 b. Specifiche mutazioni Digestione con enzimi di restrizione di DNA amplificato con PCR; controllo della grandezza dei frammenti su gel Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad oligonucleotidi allele specifici (ASO) Amplificazione di DNA usando primers allele specifici (ARMS) PCR con primers localizzati agli estremi di una delezione o di un breakpoint di traslocazione Individuazione del numero di triplette ripetute

25 Digestione con enzimi di restrizione di DNA amplificato con PCR; controllo della grandezza dei frammenti su gel

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27 M bp 165 bp Analisi della mutazione N1303K (gene CFTR: 4041 C>G) In questo caso la mutazione crea un sito di restrizione per l enzima DdeI (CTNAG), perciò l'enzima taglia il DNA con la mutazione (+ presenza della mutazione; - mutazione assente; M = marcatore di peso molecolare)

28 Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII

29 Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad oligonucleotidi allele specifici (ASO)

30 ARMS Amplification refractory mutation system (amplificazione allele specifica) Si eseguono due amplificazioni parallele. Uno dei primer è comune ad entrambe le reazioni; l altro in una reazione è specifico per l allele normale, nell altra per l allele mutato

31 PCR allele specifica

32 Multiplex ARMS test per individuare 4 specifiche mutazioni che causano la fibrosi cistica

33 PCR con primers localizzati agli estremi di una delezione o di un breakpoint di traslocazione

34 Chromosomal rearrangements or translocations Neoplasm Translocation Proto-oncogene Burkitt lymphoma t(8;14) 80% of cases c-myc 1 t(8;22) 15% of cases t(2;8) 5% of cases Chronic myelogenous t(9;22) 90-95% of cases bcr-abl 2 leukemia Acute lymphocytic t(9;22) 10-15% of cases bcr-abl 2 leukemia 1 c-myc is translocated to the IgG locus, which results in its activated expression 2 bcr-abl fusion protein is produced, which results in a constitutively active abl kinase 34

35 La proteina, codificata da c-myc attiva la trascrizione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare dalla fase G1 alla fase S. Normalmente, sia l mrna trascritto dal protooncogene, che la proteina sono molto instabili. Le cellule il cui genoma contiene le mutazioni sono costitutivamente indotte a proliferare. 35

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37 sono tipiche le traslocazioni che interessano il cromosoma 8, dove è localizzato il gene c-myc, ed uno dei tre cromosomi in cui sono localizzati i geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle immunoglobuline. La traslocazione più frequente è la [t (8:14)], che si riscontra nel 90% dei BL: la traslocazione, spostando cmyc in prossimità dell enhancer del gene che codifica per una delle catene delle immunoglobuline, causa la sua continua espressione e di conseguenza le cellule sono costitutivamente stimolate a proliferare. 37

38 c-myc is translocated to the IgG locus, which results in its activated expression c-myc c-myc is activated by the IgG enhancer in lymphocytes IgG enhancer IgG bcr-abl fusion protein is produced, which results in a constitutively active abl kinase bcr abl bcr-abl 38

39 A chromosome translocation that forms Bcr-Abl in a hematopoietic stem cell forms the diagnostic Philadelphia chromosome and results in the initial chronic phase of human chronic myelogenous leukemia (CML), characterized by an expansion in the number of well-differentiated granulocytes, a type of white blood cell. A second mutation in one such cell (e.g., in p53) leads to acute leukemia. 39

40 40

41 The chromosomal translocation results in fusion of a portion of the bcr gene (whose function is unknown but whose N-terminal segment forms a coiled-coil domain that links several bcr polypeptides together) with part of the c-abl gene, which encodes a proteintyrosine kinase whose normal substrates are not known. The chimeric polypeptides expressed from the resulting Bcr-Abl oncogene form a tetramer that exhibits constitutive Abl kinase activity. Although Abl is normally localized to the nucleus, addition of the Bcr segment causes the Bcr-Abl oncoprotein to be localized to the cytosol. Bcr-Abl binds to many intracellular signal-transduction proteins and then phosporylates them, proteins that Abl would not normally activate. As a consequence, these signaling proteins become activated in 41 the absence of growth factors.

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43 X fragile (309550) Frequenza: 1/4000 maschi. Ereditarietà: Legata al cromosoma X. Malattia causata da mutazione dinamica. Genetica: Nel 1991 è stato identificato il gene responsabile. La mutazione è caratterizzata dall amplificazione di un tratto di DNA costituito da una specifica sequenza ripetuta (CGG). Nei soggetti normali è presente un numero di ripetizioni variabili da 6 a 55. Esistono due differenti tipi di mutazione: la premutazione (56-200) e la mutazione completa (>200). La probabilità di espansione aumenta con le dimensioni della premutazione e quindi con il passare delle generazioni (Paradosso di Sherman). Diagnosi: La diagnosi molecolare (Southern blot) permette di individuare anche gli individui con la premutazione.

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45 Diagnosi di malattie da espansione di triplette ripetute

46 Real Time PCR

47 Per ogni campione da analizzare utilizzo 2 differenti sonde marcate con 2 differenti fluorofori 1) Complementare all allele wild type 2) Complementare all allele mutato e la stessa coppia di primers

48 Discriminazione allelica

49 Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente. I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non presentano mutazioni in questo marcatore. Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie sempre più mirate e su misura per il paziente.

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51 Una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per la proteina Ras, riduce la sua attività GTPasica rendendola costitutivamente attiva.

52 Cetuximab è un anticorpo monoclonale che blocca il recettore dell EGF. La proteina Ras si trova a valle di EGFR, quindi anche bloccando il recettore non si ottiene la risposta desiderata (blocco della proliferazione cellulare)

53 Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras nella biopsia del paziente Codon Mutation; Aminoacid change Nucleotide substitution 12 GGT TGT; G12C G T GGT GTT; G12V G T GGT GAT; G12D G A GGT GCT; G12A G C GGT AGT; G12S G A GGT CGT; G12R G C 13 GGC GAC; G13D G A

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