DUPLICα RealTime Mycoplasma pneumoniae Kit

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1 DUPLICα RealTime Mycoplasma pneumoniae Kit h: EBR tests INTENDED USE DUPLICa RealTime Mycoplasma pneumoniae kit is a qualitative assay for DNA detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical speciments. PRINCIPLE OF THE TEST DUPLICa RealTime Mycoplasma pneumoniae kit is an assay with the DNA-based detection of the Mycoplasma pneumoniae. The kit is designed to amplify Mp1842 cytadhesin P1 gene. The reagents for the amplification are ready to use and provided with 3 reactions mix: AMPLIFICATION MIX with Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology), nucleotides, MgCl 2 e buffer. OLIGO MIX with primers and fluorogenic probes. INTERNAL CONTROL OF AMPLIFICATION it allows to value the success of the reaction of amplification, it is identified by a hydrolysis probe. In the PCR procedure trace amounts of DNA can be quickly and repeatedly copied to produce a quantity sufficient to investigate using conventional laboratory methods. There are three basic steps involved in the PCR process: denaturation, annealing, extension. Denaturation to promote singlestrandedness of the template DNA is achieved by heating to approximately 95 C. The temperature is then lowered significantly to promote basepairing (annealing) of the primer to the template. The kit DUPLICa RealTime Mycoplasma pneumoniae kit allows to find out bacterical DNA by using specific fluorogenic sequence probes. With the kit is used a probe dyed with a different fluoride for each investigated sequence; in particular one probe detects the allele target that bound covalently as a fluorophore at the 5 -end the FAM molecule (6-carboxyfluorescein) while the other probe detects the internal control (IC) bound as a fluorophore at 5 -end the HEX molecule (hexa-chloro-fluoresceine). The two probes have at their 3 -ends a quencher called BHQ-1. REAGENTS PROVIDED Each kit contains enough reagents to perform 32 tests and includes an internal control that must be co-amplified with any sample that identifies any inhibitions in the amplification reaction. The kit allows to set up 4 assays, each of them include: 6 samples, 1 control and 1 reaction blank. For Real Time PCR Reagents Amplification mix (400 ml) Oligo Mix* (400 ml) Control 1 (Positive C. of amplification) (>50 ml) Control 2 (Internal C. of amplification) (>50 ml) Reaction blank (B) (50 ml) *store the tube away from light Colour Code Blue Cap Green Cap Red Cap Yellow Cap White Cap STORAGE AND HANDLING All reagents have to be stored at -22/-18 C. All reagents can be used until the expiration date printed on the labels. EuroClone recommends freezing and thawing the products at most six times. Warning: after complete thawing and before using the kit is recommended to spin all reagents and to resuspend them by pipetting 3 times.

2 REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Micropipette 1-10 ml Micropipette ml Sterile filter tips Rack for 0.2 ml tubes Optical tubes or microplate for Real Time PCR Thermal cycler for Real Time PCR PRECAUTIONS AND WARNINGS Do not use the reagents after the date of expiration. Mix the reagents of the kit before use. Periodically verify the calibration of micropipette and instrumentation. Change gloves frequently. Laboratory equipments (pipettes, tips etc.) should not be moved from one working area to another. Periodically wash the working area with hypochlorite 5% Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on optical caps. Do not write on caps as this may cause an interference with fluorescence detection. OPERATING PROCEDURE a) DNA extraction Any commercial bacterial DNA extraction kit could be used. b) Thermal Cycler set up Refer to the specific handbook of the equipment used but be sure to set the following thermal profile. We recommend to switch on the instrument, setting the thermal profile and having the plate ready, before preparing the reaction mix. Thermal Profile: Time Temperature Cycles 5 min 95 C 1 15 sec 95 C sec 62 C Fluorescent Acquisition c) Preparation of PCR mix For each experiment prepare a PCR mix for the 1 control (Control 1), 1 reaction blank, n+1 samples. The reagents of PCR mix have to mixed under this ratio: REAGENT VOLUME (ml) Amplification mix 10 Oligo mix 10 Control 2 (Internal C.) 1 Once the mix is ready, aliquot 21ul of Master Mix in the tubes or in the microplates for PCR and add in each tube 4ul of extracted DNA and of controls; set the tubes inside the instrument and start the program of amplification you had set before. Remember that at the end of the program remove the tubes from the thermal cycler. d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS The fluorescence signal registered by the instrument detects the presence of the DNA, in particular the fluorescence detected in the FAM channel reveals the target DNA, while the fluorescence detected in the HEX channel reveals the amplification of the internal control (Control 2). Results are interpreted by analyzing the threshold Cycle (Ct) value for each sample. The Ct is defined as the cycle at which the amplification curve crosses the threshold line. The threshold line is calculated by the mean of fluorescence background multiply by three times standard deviation during the initial cycles of PCR, prior to significant accumulation of the target amplicon. During these early PCR cycles, the background signal is used to determine the baseline fluorescence. When a signal at fluorophore FAM (Ct > 0) is detected, the sample is surely positive and the signal detected by HEX fluorophore (Ct 0) is not relevant. When no signal at fluorophore FAM (Ct = 0) is detected, to confirm the negativeness of the result, the completed amplification of internal control, and therefore the appearance of a fluorescent signal at HEX (Ct > 0) fluorophore level, must be verified. Only in this case we can state that the sample is definitely negative. The absence of amplification signal at level of the two FAM-HEX (Ct=0) fluorophores indicates the presence of inhibition of the PCR. The sample must be repeated and a dilution 1:10 of the target DNA is suggested. FAM HEX RESULT Ct > 0 Not relevant (Ct 0) POSITIVE Ct = 0 Ct > 0 NEGATIVE Ct = 0 Ct = 0 INHIBITION

3 Warning: The run is valid only if: The Blank is positive in the HEX channel, but negative in the FAM channel. The Positive Control is positive in both the FAM and for the HEX channel. If these two conditions have been met, the run is valid and it s possible to analyse the data. Otherwise the run is not valid. It is responsibility of the user to validate the run checking that these conditions have been met. TROUBLESHOOTING Problem 1: No signal 1. Wrong channel/filter was chosen. 2. Pipetting error due to omitted reagents or samples. 3. Inhibitory effect of the sample: genomic DNA with a insufficient purification and/or insufficient extraction. 4. Check the kit was stored correctly. 5. Assess the performance of the thermal cycler. Problem 2: Fluorescence intensity too low 1. Deterioration of dyes and/or primers in the reagents due to unsuitable storage conditions. 2. Very low starting amount and/or purity of genomic DNA. Problem 3: Fluorescence intensity varies 1. The prepared PCR master mix is not well mixed. 2. Air bubbles trapped in the PCR tubes. THE PURCHASE OF THIS PRODUCT GRANTS THE PURCHASER RIGHTS UNDER CERTAIN ROCHE PATENTS TO USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO DIAGNOSTIC SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER LICENSE OF ANY KIND OTHER THAN THIS SPECIFIC RIGHT OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY

4 DUPLICα RealTime Mycoplasma pneumoniae Kit h: EBR tests FINALITA D USO DUPLICa RealTime Mycoplasma pneumoniae kit è un test qualitativo, impiegato per la ricerca del DNA batterico di Mycoplasma pneumoniae in campioni clinici. PRINCIPIO DEL TEST DUPLICa RealTime Mycoplasma pneumoniae kit é un test molecolare basato sul riconoscimento del DNA di Mycoplasma pneumoniae. E stato sviluppato per amplificare il gene Mp1842 citoadesina P1. I reagenti per la reazione di amplificazione sono pronti all uso e suddivisi in tre mix di reazione: AMPLIFICATION MIX: contenente Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology), nucleotidi, MgCl 2 e buffer. OLIGO MIX contenente i primers e le sonde fluorogeniche. CONTROLLO INTERNO DI AMPLIFICAZIONE: permette di valutare il successo della reazione di amplificazione, ed è identificato da una specifica sonda a idrolisi. La polymerase chain reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare una sequenza target di DNA generando numerose copie di un templato. La reazione si compone generalmente di tre fasi: denaturazione del DNA, annealing (appaiamento dei primers) ed estensione. Queste fasi, che si realizzano attraverso riscaldamenti e raffreddamenti automatizzati mediante un termociclatore, rappresentano un ciclo di amplificazione; la ripetizione in continuo del ciclo base porta alla produzione di miliardi di frammenti del DNA in studio. Alla denaturazione del DNA che avviene ad alte temperature segue l appaiamento di specifici primers al DNA target: l enzima Taq polymerase riconosce le estremità 3 di questi primers ed utilizzando i nucleotidi trifosfati (dntps) polimerizza il DNA, creando in questo modo numerose copie del templato. In tutti i sistemi PCR real-time la rivelazione dell amplificato avviene utilizzando un marcatore fluorescente che nelle sonde fluorogeniche viene chiamato reporter. Il kit DUPLICa RealTime Mycoplasma pneumoniae kit permette di rilevare il DNA batterico mediante l impiego di sonde fluorogeniche sequenza specifiche. Le sonde fluorogeniche sono costituite da una sequenza oligonucleotica che presenta all estremità 5 un marcatore fluorescente chiamato «reporter», mentre all estremità 3 legano un secondo marcatore chiamato «quencher». Il saggio è in grado di rilevare il prodotto specifico di amplificazione andando a monitorare l incremento del segnale di fluorescenza che risulta essere direttamente proporzionale alla quantità di prodotto amplificato; l elevata specificità del sistema consente alla sonda di discriminare tra frammenti che differiscono di un solo nucleotide. Nel kit viene usata una sonda marcata con un differente fluoroforo per ogni sequenza investigata; in particolare una sonda che va a rilevare l allele target e ha legato in modo covalente come fluoroforo all estremità 5 la molecola FAM (6-carbossi-fluoresceina) mentre l altra sonda che va a rilevare il controllo interno (IC) ha legato come fluoroforo all estremità 5 la molecola HEX (Esa-cloro-fluoresceina). Le due sonde hanno all estremità 3 un quencher chiamato BHQ-1. Se eccitata, la sonda integra non emette fluorescenza, in quanto la vicinanza del quencher al reporter, impedisce a quest ultimo l emissione della fluorescenza (effetto di quenching). COMPOSIZIONE DEL KIT Questo Kit è stato disegnato per poter eseguire 32 reazioni, è incluso un controllo interno di amplificazione che deve essere coamplificato insieme ad ogni campione e che permette di identificare inibizioni nelle reazioni di amplificazione. Il kit permette di effettuare 4 corse, ciascuna delle quali include: 6 campioni, 1 controllo e 1 bianco di reazione.

5 Real Time PCR Reagenti Amplification mix (400 ml) Oligo Mix* (400 ml) Control 1 (Positive C. of amplification) (>50 ml) Control 2 (Internal C. of amplification) (>50 ml) Reaction blank (B) (50 ml) *proteggere la provetta dalla luce Codice colore Tappo Blu Tappo Verde Tappo Rosso Tappo Giallo Tappo Bianco Conservazione e Stabilità Tutti i reagenti devono essere conservati a -22/-18 C fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. EuroClone raccomanda di non scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte. Attenzione: dopo il completo scongelamento e prima dell utilizzo si raccomanda di centrifugare tutti i reagenti e risospenderli pipettandoli 3 volte. MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO Micropipette 1-10 ul Micropipette ul Puntali con filtro Rack per tubi da 0.2 ml Micropiastra ottica per real time PCR Tubi per PCR da 0. 2 ml con tappi ottici Termociclatore per Real Time PCR PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI DI UTILIZZO La strumentazione di laboratorio (pipette, tubi, etc.) non deve circolare da una stazione di lavoro all altra. Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza. Miscelare i reagenti del kit prima dell utilizzo. Periodicamente verificare la precisione delle pipette, e il corretto funzionamento della strumentazione. Cambiare spesso i guanti. Lavare periodicamente il banco di lavoro con Ipoclorito al 5%. Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare ditate sui tappi ottici. Non scrivere sui tappi, questo potrebbe creare dei problemi nella rivelazione della fluorescenza. PROTOCOLLO OPERATIVO a) Estrazione DNA Qualsiasi kit commerciale. b) Programmazione del termociclatore Riferirsi allo specifico manuale dello strumento ma assicurarsi di impostare il seguente profilo termico: Profilo Termico: Tempo Temperatura Cicli 5 min 95 C 1 15 sec 95 C sec 62 C Acquisizione Fluorescenza Si suggerisce, prima di allestire la miscela di reazione, di accendere e programmare il termociclatore per Real Time PCR. c) Preparazione della PCR mix Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per 1 controllo (Controllo 1), 1 bianco di reazione, n campioni più uno. La mix deve essere preparata miscelando i reagenti nei rapporti volumetrici di seguito indicati: REAGENTI VOLUME (ml) Amplification mix 10 Oligo mix 10 Controllo 2 (C. Interno) 1 Terminata la preparazione della mix, aliquotare 21ul della Master Mix nei tubi o nelle micropiastre per PCR e aggiungere in ogni tubo 4ul di DNA estratto e dei controlli; disporre i tubi all interno dello strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente impostato. Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere i tubi dal termociclatore. d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI Il segnale di fluorescenza registrato dalla strumentazione identifica la presenza del DNA, in particolare la fluorescenza rilevata dal CANALE FAM identifica il DNA target, mentre la fluorescenza rilevata dal CANALE HEX identifica l amplificazione del Controllo Interno (Controllo 2). I risultati sono interpretati attraverso l analisi del ciclo soglia Ct (Threshold Cycle Ct) per ciascun campione.

6 Il ciclo soglia è definito come il ciclo, a livello del quale, la curva di amplificazione interseca la linea soglia (Threshold line). La linea soglia viene calcolata dalla media della fluorescenza di background per tre volte la deviazione standard; durante i cicli iniziali di amplificazione, prima di un significativo accumulo di DNA target. Durante i primi cicli di amplificazione della PCR viene calcolata la fluorescenza di background utilizzata per il calcolo della fluorescenza basale. Quando si registra un segnale a livello di fluoroforo FAM (Ct > 0), il campione è sicuramente positivo, ed il segnale rilevato dal fluoroforo HEX (Ct 0) non è rilevante. Quando non si registra segnale a livello di Fluoroforo FAM (Ct = 0), per confermare la negatività del risultato, si deve verificare l avvenuta amplificazione del controllo interno e quindi la comparsa di un segnale di fluorescenza a livello di Fluoroforo HEX (Ct>0). Solo in questo caso si può affermare che il campione è sicuramente negativo. L assenza di segnale di amplificazione a livello dei due fluorofori FAM-HEX (Ct=0) indica la presenza di inibizione della PCR. Il campione deve essere ripetuto, si suggerisce di effettuare una diluizione 1:10 del DNA target. FAM HEX RISULTATO Ct > 0 Non Rilevante (Ct 0) POSITIVO Ct = 0 Ct > 0 NEGATIVO Ct = 0 Ct = 0 INIBITO Attenzione: La corsa é valida solo se: Il Bianco é positivo nel canale HEX e negativo nel canale FAM. Il Controllo Positivo é positivo sia nel canale FAM che nel canale HEX. Se si verificano queste due condizioni la corsa risulta valida ed é possibile analizzare I dati, altrimenti la corsa non é valida. É responsabilità dell operatore convalidare la corsa controllando che queste due condizioni si siano verificate. TROUBLESHOOTING Problema 1: Mancanza completa di segnale 1. E stato scelto il canale/filtro sbagliato. 2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione. 3. Effetti inibitori del campione: DNA genomico con purificazione insufficiente e/o estrazione insufficiente. 4. Controllare la corretta conservazione del kit. 5. Controllare le prestazioni del termociclatore. Problema 2: Intensità di fluorescenza è troppo bassa 1. Deterioramento del fluoroforo e/o dei primer dovuto ad una cattiva condizione di conservazione del Kit. 2. Quantità di DNA troppo inferiore e/o di bassa purezza. Problema 3: Intensità di fluorescenza variabile 1. La PCR Master Mix non è stata miscelata in modo corretto. 2. Ci sono bolle d aria intrappolate nei tubi di PCR. L acquisto di questo prodotto assicura all acquirente i diritti coperti da alcuni brevetti Roche allo scopo unico di offrire servizi di diagnostica umana in vitro. L acquisto di questo prodotto non concede nessun altro brevetto generale, diritto o licenza di alcun tipo, al di fuori dello specifico diritto di utilizzo. Rev 0 EBR

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