Ruolo dei test di clonalità nei disordini linfoproliferativi

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1 XIX CORSO NAZIONALE PER TECNICI DI LABORATORIO BIOMEDICO Riccione, Maggio 2012 Ruolo dei test di clonalità nei disordini linfoproliferativi Dr.ssa Claudia Mannu Laboratorio di Patologia Molecolare, Sezione di Emolinfopatologia, Dipartimento di Ematologia e Scienze Oncologiche "L. and A. Seràgnoli", Ospedale S. Orsola Malpighi, Università di Bologna

2 Diagnosi di Disordine Linfoproliferativo Morfologia Immunofenotipo Caratteristiche cliniche Lesioni Geniche Nel 10-15% dei sospetti disordini linfoproliferativi, la diagnosi differenziale tra una proliferazione reattiva e neoplastica risulta piuttosto complicata

3 Analisi di clonalità nello studio delle malattie linfoproliferative Nella diagnosi differenziale di neoplasia vs reazione iper-immune è spesso necessario effettuare un analisi di clonalità Analisi del riarrangiamento dei geni delle catene pesanti delle immunoglobuline (IGH) per la linea B Analisi del riarrangiamento dei geni del recettore dei linfociti T (TCR) per linea T

4 Le cellule neoplastiche derivano da una singola cellula trasformata Tutte le cellule della neoplasia contengono riarrangiamenti genici identici e quindi monoclonali, che sono identificabili attraverso tecniche molecolari

5 I marker più utilizzati: IG E TCR IG TCR Catene Leggere V a V b CD3 e CD3 d C a C b CD3 g Catene Pesanti CD3 x CD3 x IGH@ IGK@ o IGL@ TRA@/TRB@ TRG@/TRD@

6 Immunoglobuline Catene leggere Catene pesanti V D J V Variable region D Diversity region J Joining region IGH@ IGK@ or IGL@

7 T-Cell Receptor V a V b CD3 e CD3 d C a C b CD3 g CD3 x CD3 x Esiste una fisiologica gerarchia di riarrangiamento: 1. Riarrang. d 2. Riarrang. g 3. Riarrang. b 4. Riarrang. a TRA@/TRB@ TRG@/TRD@

8 Riarrangiamento V(D)J Repertorio combinatoriale >98% dei disordini linfoproliferativi, mostrano un identico riarrangiamento dei geni che codificano per le immunoglobuline (IG) e/o per il T cell receptor (TCR)

9 Analisi di clonalità delle IG e/o del TCR nella routine ematopatologica Tecnica molecolare d elezione : PCR Semplice e veloce, permette l amplificazione di piccole quantità di DNA (0,05-0,1 g) compreso DNA estratto da tessuti paraffinati la cui qualità risulta essere subottimale.

10 BIOMED-2 Concerted Action strategy van Dongen et al Leukemia (2003) 17, Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal IG and TCR gene recombinations in suspect lymphoproliferations

11 BIOMED 2 - Analisi delle IG e del TCR Creazione di set di primes che permettono lo studio di loci genici di ampie dimensioni I primers vengono utilizzati contemporaneamente e sono miscelati in un unico tubo di reazione, così da coprire il maggior numero di combinazioni possibili tra i vari segmenti genici V (D) e J PCR MULTIPLEX

12 locus Ogni set di primer senso consiste in 6 o 7 oligonucleotidi disegnati sulle regioni variabili e viene usato in congiunzione con un singolo primer antisenso (JH) disegnato sulla regione di Joining

13 locus

14 Visualizzazione del prodotto di PCR Gene Scan Utilizzo primers marcati Denaturazione prodotto di PCR Separazione su elettroforesi capillare (sequenziatore)

15 Monoclonale/oligoclonale/policlonale 1 o 2 picchi: monoclonale Da 3 a 5 picchi: oligoclonale Distribuzione Gaussiana: policlonale

16 Sensibilità dei test di clonalità PCR Tubes Sensitivity B-cell malignancies IGH VH JH 82% IGH DH JH 45% IGH VH JH+IGH DH JH 92% IGK 92% IGL 31% IGH VH JH+IGK 98% IGH VH JH+IGL 82% IGH VH JH+IGH DH JH+IGK 98% IGH VH JH+IGH DH JH+IGK+IGL 98% T-cell malignancies TCRG 89% TCRB 94% TCRD 11% TCRG+TCRB 100% TCRG+TCRB+TCRD 100%

17 Analisi di clonalità nel nostro laboratorio Effettuata su casi di difficile interpretazione Utilizzo di protocolli specifici per campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina

18 analisi 59 Disordini linfoproliferativi B nei quali l analisi del riarrangiamento dei geni delle IGH@ non è stato d aiuto alla diagnosi Mannu C et al, Am J Blood Res 2011

19 Accuratezza dell analisi delle Blinded Histopathology Review B-NHL RLH Monoclonali % PPV IGK@ Policlonali % NPV 82.61% 80.00% ST SP Mannu C et al, Am J Blood Res 2011

20 Number of cases Linfoma follicolare e Linfoma marginale: due entità che richiedono maggiormente l analisi di clonalità IGH IGK MZL FL DLBCL HL Indolent NOS RLH PBL Mannu C et al, Am J Blood Res 2011

21 conclusioni Nella maggior parte dei casi, l analisi molecolare ha supportato la diagnosi istopatologica In una porzione di casi, l analisi delle IGK@ ha avuto un ruolo chiave nello stabilire la diagnosi finale Le IGK@ non vanno incontro al processo di ipermutazione somatica come le IGH@ pertanto si ha una bassa presenza di risultati falsi negativi L analisi del riarrangiamento delle IGK@ è fattibile ed efficace nella routine ematopatologica Un risultato negativo dell analisi delle IGH@ non può essere considerato conclusivo pertanto, è consigliata l ulteriore analisi del riarrangiamento dei geni che codificano per le IGK@

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