HPV: METODI DI RIVELAZIONE E. Roberta Cerutti, U.O. Anatomia Patologica Varese 8 novembre 2014
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1 HPV: METODI DI RIVELAZIONE E UTILITA DIAGNOSTICA Roberta Cerutti, U.O. Anatomia Patologica Varese 8 novembre 2014
2 Papilloma Virus Umano (HPV) Virus a DNA circolare a doppio filamento, di 7800 bp Capside a simmetria icosaedrica di 72 capsomeri, senza envelope Specie specifici, più di 130 tipi noti nell uomo Si replicano nel nucleo delle cellule epiteliali squamose (tropismo per epiteli cutaneo e mucoso) Agenti eziologici di lesioni cutanee e delle mucose
3 L INFEZIONE DA HPV 4. RILASCIO DELLE PARTICELLE VIRALI INTERE 1. INFEZIONE DELLE CELLULE PROLIFERANTI (STAMINALI) DELLO STRATO BASALE 3. REPLICAZIONE DEL VIRUS ED ESPRESSIONE DI GENI VIRALI TARDIVI (LATE GENES): FORMAZIONE DEL CAPSIDE 2. ESPRESSIONE DEI GENI VIRALI PRECOCI (EARLYGENES E5,E6,E7)
4 Patogenesi delle lesioni da HPV
5 Effetti delle oncoproteinevirali: E6 Interagiscee degradap53 e la proteina pro-apoptotica BAK RESISTENZA ALL APOPTOSI AUMENTO DELL INSTABILITA CROMOSOMICA Attivale telomerasie inibiscela degradazione delle kinasi della famiglia SRC STIMOLAZIONE DELLA PROLIFERAZIONE
6 Effetti delle oncoproteinevirali: E7 Si legaallaforma ipofosforilatadirb promuovendonela proteolisi stimolaigeniciclinaa ed E ebloccala funzionedi p21 e p27 SREGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE
7 HPV: Ruolo causale ma non sufficiente per spiegare il carcinoma della cervice
8 Caratteristiche dell infezione da HPV 6-12 MESI 4-5 ANNI 9-15 ANNI
9 Fattori di rischio di persistenza virale Anomalie citologiche di basso grado carica virale fumo Risposta immunitaria anticorpale NK TLR CD4 CD8 Immunodepressione Uso prolungato di contraccettivi orali Fumo Coinfezioni(C. Trachomatis ) Elevata parità Carica e tipo virale
10 I VIROTIPI classificazione filogenetica Oltre 100 virotipisequenziati, di cui 40 infettano il tratto genitale
11 Classificazione epidemiologica
12 IARC 2009: rischio oncogeno dei tipi di HPV
13 70% Virotipi HPV nei carcinomi cervicali
14 IARC 2009: HPV 16
15 Tumori HPV HPV-correlati e tumori Sedi Anogenitali SEDE Carcinomi della cervice uterina Carcinomi anali Carcinomi vaginali Carcinomi della pene vulva Carcinomi della pene vulva % Tumori HPV correlati 100% 85-95% 55-75% 40-50% 20-30% Carcinomi dell orofaringe Carcinomi del cavo orale 25-60% 10-30% Testa-collo
16 Tumori HPV-correlati in USA (anno 2009)
17 Identificazione di HPV in diagnostica: applicazioni cliniche 1. RICERCA DI HR-HPV IN CAMPIONI CITOLOGICI CERVICALI a. Test di triage o di secondo livello per identificare donne con ascus/lsil da inviare alla colposcopia per diagnosi ed eventuale trattamento b. Test di follow-up per prevedere le possibili recidive di lesioni trattate con procedure locali ablative/escissionali (lesioni ad alto grado) c. Test primario di screening per identificare soggetti a rischio di lesioni precancerose della cervice uterina
18 Follow-up post conizzazione HR-HPV positivo a 6 mesi dal trattamento è predittivo di una successiva recidiva con una sensibilità del 90% (62% per citologia) La specificità è paragonabile a quella della citologia Il valore predittivo negativo di un HR-HPV negativo con paptest normale è del 99% Nobbenhuis, Br J Cancer 2001
19 La strategia di lavoro in anatomia patologica DIAGNOSI di 2 LIVELLO In pazienti con HSIL e LSIL pregresse e/o persistenti In pazienti con lesioni citologiche di significato indeterminato (ASCUS) Ricerca e tipizzazione virale In pazienti con HSIL trattate chirurgicamente (conizzazione) Monitoraggio nel tempo della persistenza virale nel follow-up
20 HPV come test di screening primario STUDIO ITALIANO NTCC (Nuove Tecnologie per lo screening del Carcinoma Cervicale) : trial multicentrico randomizzato su donne in 9 centri di screening in Italia (Ronco Lancet Oncol 2010; 11(3): ) Sensibilità Specificità Studio NTCC HPV Cytology Valle Camonica Trento Torino Firenze Padova Ferrara Reggio Emilia Abruzzo Roma : studi pilota in Italia
21 HPV come test di screening primario Il rapporto di Health Tecnology Assessment italiano del 2012 Ricerca del DNA di Papilloma Virus Umano (HPV) come test primario per lo screening dei precursori del cancro del collo uterino (Epidemiol Prev 2012; 36(3-4) suppl1) considera raccomandabile il test HPV per lo screening primario: 1. A partire dai anni; al di sotto di tale fascia è raccomandato lo screening citologico perché è elevato il rischio di diagnosticare/trattare lesioni che regrediscono spontaneamente 2. Le donne positive al test HPV NON vanno indirizzate direttamente alla colposcopia, ma ad un test di triage CITOLOGICO(pap test)
22 Algoritmo: HPV come test di screening primario con triage citologico 5 anni L elevato valore predittivo negativo rende possibile allungare l intervallo di screening Necessaria centralizzazione dei percorsi diagnostici e validazione dei protocolli di ricerca HPV-DNA (Linee Guida Europee)
23 Identificazione di HPV in diagnostica: applicazioni cliniche 2. RICERCA DI HPV IN CAMPIONI TUMORALI FRESCHI o FISSATI IN FORMALINA ED INCLUSI IN PARAFFINA(FFPE) Ruolo diagnostico Origine cervicale o orofaringea di lesioni metastatiche Diagnosi di displasie anogenitali a dubbia morfologia Identificazione di micrometastasilinfonodalida CxCain stadio I-II Indicazione prognostica Carcinomi squamosi dell orofaringe Futuro: Scopo predittivo -di orientamento per la terapia
24 HPV nei carcinomi squamosi testa-collo Studi caso-controllo D Souza 2007
25 HPV nei carcinomi squamosi testa-collo Evidenze sperimentali 1. HR-HPV DNA (prevalentemente tipo 16) presente in modo specifico nei nuclei delle cellule tumorali 2. Dimostrata l espressione degli oncogeni virali E6-E7 3. Presenza di alterazioni genetiche indicative di funzionalità delle oncoproteine E6-E7 4. Esiste integrazione virale nelle cellule tumorali 5. Silenziando l espressione di E6-E7 nelle cellule tumorali HPV+ in coltura si reverte il fenotipo maligno
26 HPV nei carcinomi squamosi testa-collo Kreimer A, 2005
27 HPV come fattore prognostico Carcinomi squamosi dell orofaringe Motivi ancora non del tutto noti: Maggiore radiosensibilità e chemiosensibilità della neoplasia Risposta immunitaria efficace No effetto di cancerizzazione di campo Cancer Prev Res 2009
28 Classi di rischio per i carcinomi orofaringei HPV Numero di sigarette fumate Stadio di malattia/metastasi linfonodali Ang NEJM 2010
29 La diagnosi di infezione da HPV No possibilità di coltura in vitro No saggi sierologici affidabili per infezioni in atto o pregresse da HPV METODI MOLECOLARI
30 Quante metodiche molecolari? Identificati 125 test HPV!
31 Quali metodi per l utilizzo nello screening? i. Validati da studi clinici ampi e attendibili ii. Approvati dalla FDA ed utilizzati in accordo alle specifiche indicazioni fornite dall ente iii. Rispettano i criteri di performance e di adeguatezza clinica (Meijer 2009) SENSIBILITA CLINICA: proporzione di donne con lesioni CIN2+ correttamente identificate da un test HPV positivo (NO FALSI NEGATIVI) SPECIFICITA CLINICA: proporzione di donne senza lesioni CIN2+ correttamente identificate da un test HPV negativo (NO FALSI POSITIVI)
32 Test validati per utilizzo clinico
33 Amplificazione del segnale: HybridCapture2 Procedura standardizzata con sensibilità clinica ottimale Ibridazione in fase liquida e cattura dell ibrido su supporto solido Sonde per 13 tipi virali HR (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68) e 5 tipi virali LR (6,11,42,43,44) Denaturazione degli acidi nucleici Ibridazione del DNA con sonde a RNA in fase liquida Cattura degli ibridi DNA/RNA su micropiastracon anticorpi universali Rivelazione degli ibridi catturati con anticorpi multipli coniugati con fosfatasi alcalina (AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE) Misurazione del segnale chemiluminescenteprodotto dalla scissione del substrato con luminometro
34 HybridCapture2 Utilizzabile per campioni citologici cervicali raccolti in fase liquida o per biopsie cervicali congelate in STM Il test ha una sensibilità clinica del 96% e valore predittivo negativo (VPN) del 99% E il test commerciale più utilizzato, per la semplicità, la possibilità di automazione ed i costi relativamente limitati Estesa validazione clinica; tutti i metodi da implementare devono essere posti a confronto con questo (MeijerJ ClinVirol2009) LIMITI: non permette di definire lo specifico genotipo Sensibilità inferiore rispetto alla PCR Cross reattività fra i pool di sonde (scarsa specificità, presenza di falsi positivi)
35 Test basati sulla PCR (amplificazione del target) Alcuni sono validati per utilizzo clinico(abbott HR HPV test e COBAS 4800 HPV test) Primersutilizzati per amplificare regioni altamente conservate del genoma virale nelle regioni L1, E6, E7 Tecnica altamente sensibile, richiede quantità minime di campione e può essere automatizzata per campioni citologici in fase liquida o tessuti freschi e paraffinati
36 Finalità dei test basati sulla PCR 1. Identificare la presenza di DNA di HPV (es. AMPLICOR Roche.) 2. Identificare quale genotipo di HPV è presente (TIPIZZAZIONE VIRALE)(es. ClinicalArray, InnoLipa, Linear Array, sequenziamento diretto) 3. Identificare l espressione delle oncoproteine virali E6-E7 mediante analisi dei trascritti (es. PreTect HPV-proofer, Aptima) 4. Determinare la carica virale dell infezione da HPV (Real time PCR quantitativa) Test con utilità clinica attuale Utilizzo clinico limitato Biomarkerdi predittività? Biomarkerdi predittività?
37 1. Test di identificazione di HR-HPV Esempio: AMPLICOR HPV TEST Test qualitativo in vitro per l amplificazione del DNA di HPV Campioni citologici in fase liquida Identifico 13 tipi di HR-HPV (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68) Controllo interno: gene b-globina umano Sensibilità clinica 96% Specificità clinica 95,6%
38 Metodiche di Real time PCR per identificazione di HR-HPV e tipizzazione Abbott HR HPV test Mix di primersgp5+/6+ che amplificano 150 bpdi una regione consenso di HPV L1. Identifico HPV 16 e 18 in modo specifico, e una miscela dei 12 tipi ad alto rischio. Altissima processività COBAS 4800 HPV test Identifico HPV 16 e 18 in modo specifico, e una miscela dei 12 tipi ad alto rischio. Altissima processività GeneXpert HPV assay Identifico HPV 16 e 18/45 in modo specifico, e una miscela dei 12 tipi ad alto rischio. Sistema in cartuccia chiuso, automatizzato
39 2. Test di tipizzazione virale Sono importanti per la gestione delle donne HR-HPV positive: Per la definizione di infezione persistente (ELEVATO RISCHIO DI PROGRESSIONE NEOPLASTICA) Forniscono una stratificazione del rischio per CIN3+ delle infezioni persistenti in base al tipo presente Utili nel follow-up delle lesioni trattate chirurgicamente Sono fondamentali per gli studi epidemiologici sulla distribuzione dei tipi e per gli studi di monitoraggio dell efficacia dei vaccini
40 Metodiche basate su ibridazione inversa e rilevazione colorimetrica INNOLiPA Genotyping extra assay Utilizzo sonde tipo-specifiche adese a strisce di nitrocellulosa Amplificazione con primers SPF10, identifica 28 genotipi di HPV (HR e LR) Controllo interno: gene HLA-DPBL Adattabile a campioni citologici o a istologici freschi-paraffinati
41 Metodiche Metodiche basate basate su ibridazione su inversa e e rilevazione colorimetrica colorimetrica Linear Array Assay Amplificazione con primerspgmy, che identifica 37 genotipi di HPV (HR e LR) Adattabile a campioni citologici o a istologici freschi-paraffinati Sensibilità clinica 96% Specificità clinica 99%
42 Metodiche Metodiche basate basate su ibridazione su inversa e e rilevazione colorimetrica colorimetrica ClinicalArray HPV TEST (in uso in AP Varese) Test qualitativo in vitro per l amplificazione del DNA di HPV Campioni citologici in fase liquida Identifico 35 tipi di HR-HPV e LR-HPV (primerspgmy) Controllo interno: gene CFTR Utilizzo di un array con sonde oligonucleotidiche tipo-specifiche Sensibilità clinica 98,2% Specificità clinica 100%
43 3. Test per identificazione dell HPV-RNA Per identificare le lesioni a basso/alto grado HPV DNA + con maggior rischio di progressione (valutazione del rischio di sviluppo di un CxCA) Identificazione dei RNA virali (la persistenza dell espressione di E6-E7 è il principale fattore di rischio) APTIMA HPV assay Identifica HPV E6-E7 RNA di 14 tipi virali ad alto rischio con elevata sensibilità e specificità per le lesioni più avanzate. No cross-reattività con LR-HPV. Completamente automatizzabile, approvato FDA. No tipo specifico PreTect HPV-Proofer(Real time multiplex NASBA) Set di primers/probesspecifiche per identificare 5 genotipi virali HR (16,18,31,33,45) identificando il mrna di E6/E7 (molecular beacon DNA probes) No tipo specifico
44 4. Real time PCR quantitativa Tecnica di amplificazione del DNA con monitoraggio continuo dei prodotti di amplificazione nel tempo Elevata sensibilità, riproducibilità E un approccio di elezione per la quantificazione degli acidi nucleici, utile per la determinazione della carica virale di HPV Alta carica virale = maggior rischio di sviluppare CxCA? (Dato controverso) Broccolo Journal of Med Virol 81: (2009)
45 Ibridazione in situ Utilizzo cocktail di sonde di HPV DNA ad alto rischio (18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 66) marcate con DNP. Metodica automatizzata, rivelazione colorimetrica NBT-BCIP Vantaggi: identifico il virus nel nucleo delle cellule tumorali (morfologia conservata), valutando intensità di segnale e percentuale di cellule marcate (ottima tecnica per identificazione HPV nei tessuti, elevata specificità) Identifico il pattern di marcatura diffuso (episomale) e puntiforme (integrato) Svantaggi: sensibilità inferiore rispetto alla PCR
46 Ruolo di p16 come markerdi infezione da HPV La positività Immunoistochimicaper la proteina p16 è un importante marcatore di presenza di HPV trascrizionalmente attivo nel tumore (es. tumori dell orofaringe) Fornisce inoltre un indicazione di rischio di progressione nelle lesioni pre-neoplastiche cervicali
47 conclusioni HPV correlato non solo a neoplasie cervicali ma anche a tumori di diverse sedi Impatto diagnostico rilevante della ricerca di HPV Identificazione precoce di lesioni preneoplastiche della cervice Gestione degli iter diagostici-terapeutici-difollowup nelle donne con lesioni cervicali Analisi di campioni pre-tumorali o tumorali a scopo diagnosticoprognostico Moltissime metodiche molecolari a disposizione, la scelta è da effettuare in base allo specifico obiettivo HC2 diffuso per lo screening primario (semplice, costi bassi) Tecniche basate sulla PCR diffuse ed automatizzabili, si stanno diffondendo sempre più in ambito clinico Allo studio tecniche nuove e biomarcatori per stratificare il rischio (p16, tipizzazione, carica virale, RNA delle oncoproteine virali ecc.)
48 Grazie dell attenzione!
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