RT-PCR PER RICERCA DI VIRUS IFLUENZALI A

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1 METODO NAZIONALE STANDARD RT-PCR PER RICERCA DI VIRUS IFLUENZALI A VSOP 42 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 1 di 13 Riferimento no: VSOP 42i2

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Si informa il lettore che la tassonomia completa di questo documento è aggiornata al momento della pubblicazione. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2009). RT-PCR for the detection of Influenza A viruses. National Standard Method VSOP 42 Emissione 2. Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 2 di 13

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 INTRODUZIONE CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE PRELIEVO DEL CAMPIONE TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA STRUMENTAZIONE REAGENTI PROCEDURA LABORATORIO DI RIFERIMENTO SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI REGIONALI E CENTRE FOR INFECTIONS) CONTATTI.. 9 APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR APPEDICE 2. PREPARAZIONE MASTERMIX PER TRANSCRIZIONE INVERSA APPENDICE 3 RICERCA DELLA MATRICE DI INFLUENZA A CON BLOCK BASED RT-PCR 12 BIBLIOGRAFIA Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 3 di 13

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato VSOP 47 RT-PCR per ricerca di virus influenzali A Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 1/ Tutte Tutte Nome Dipartimento modificato da ESL a DEST 2 Stato dei MNS Inserita informazione per la tassonomia 6, 7 & 10 Reagenti Procedure Appendice 2 Fornitore tampone PCR aggiornato a Invitrogen 9 Contatti Aggiornati Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 4 di 13

5 RT-PCR PER LA RICERCA DI VIRUS INFLUENZALI A Tipo di campione Campioni respiratori Tamponi Nasali e Faringei Aspirati naso-faringei Lavaggio broncoalveolare Aspirato endotracheale Espettorato INTRODUZIONE Scopo Questo Metodo Nazionale Standard descrive un saggio RT-PCR block-based utilizzato per la ricerca dei virus influenzali A in campioni clinici (secrezioni respiratorie). Sono descritte le fasi necessarie per l esecuzione di una reazione di trascrizione inversa (RT - reverse-transcription) usando esameri a random, seguita da un saggio specifico di PCR block based per influenza sul cdna generato, con sonde specifiche per i virus influenzali A 2. Il rilievo dei prodotti amplificati con la PCR avviene con luce UV, dopo colorazione con bromuro di etidio. Il saggio più sensibile per la diagnosi differenziale dei virus influenzali A nei campioni clinici è la ricerca specifica con RT-PCR per il loro RNA virale. Questo saggio utilizza solo primer specifici per i virus influenzali A, differenziandoli dagli altri patogeni respiratori. I primer utilizzati in questo saggio sono stati progettati per riconoscere regioni conservate della matrice genomica dei virus influenzali A di origine umana, aviaria e suina. Per verificare la specificità del saggio è stato valutato un panello di virus influenzali A (sottotipi H1-H14) e di virus influenzali B 2. Il rilievo di un virus di influenzale A con saggio RT-PCR è dovuto all amplificazione della matrice di uno specifico gene con dimensione caratteristica (413bt). Sebbene il riconoscimento della specie di origine della matrice genomica virale non possa essere ottenuta con il solo amplificato, la successiva analisi delle sequenze nucleotidiche di questo prodotto può differenziare la struttura genomica dei ceppi virali A H5 recentemente isolati nel 2004 da quella di altri virus aviari, umani o suini. Si deve notare che il saggio RT-PCR descritto in questo documento non fornisce alcuna informazione sul sottotipo dei geni emoagglutinina o neuramidasi dei virus influenzali A rilevati. Abbreviazioni: RT PCR = = Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction MMLV = Molonely Murine Leukaemia Virus TBE = Tris boric acid, ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA) Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 5 di 13

6 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA RACCOLTA DEL CAMPIONE Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali. 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto. Usare un sistema di trasporto per virus idoneo (ove richiesto) ed inserire il campione in contenitore o sacchetto di plastica chiuso. Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali. 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Se il campione(i) da analizzare proviene da un paziente con sospetta influenza aviaria, tutte le manipolazioni sui materiali clinici devono essere eseguite in ambiente con livello di contenimento 3 (CL3) all interno di cabine di sicurezza di classe I/casse III. Dopo avere aggiunto il materiale clinico al tampone di lisi utilizzato per la procedura di estrazione, la successiva estrazione dell acido nucleico può essere eseguita in CL2. Buona pratica di laboratorio Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e la valutazione del rischio 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA Il campione deve essere processato il più presto possibile. In teoria, i sistemi di trasporto devono garantire l arrivo del campione in laboratorio entro 24 ore. 3 STRUMENTAZIONE Thermal cycler Bagno ad acqua Blocco di riscaldamento Apparecchiatura per elettroforesi Transilluminatore UV Provette di polipropilene da 0.5mL e 0.2mL Pipette con puntali monouso con filtro 4 REAGENTI 10x PCR buffer (Gibco) minus MgCl 2 (200mM Tris-HCl;500mM KCl; ph 8.4) 50mM MgCl 2 dntp mix (ciascun dntp a 10mM) Random hexamer mix (0.5µg/µL) RNasin (40,000U/mL) MMLV reverse transcriptase (200U/µL) Altri primer (5pmol/µL) AMP71F 5 CCGTCAGGCCCCCTCAAAGC 3 ; AMP831R 5 AGGCGATCAAGAATCCACAA 3 Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 6 di 13

7 Inner primers (25pmol/µL) AMP227F 5 GTGCCCAGTGAGCGAGGAC 3 ; AMP622R 5 ATCTCCATGGCCTCTGCT 3 Taq polymerase (5U/µL) Loading/tracking dye (10% Ficoll, 0.25% Orange G in Tris-EDTA) Agarose (Multipurpose) Running buffer (1x) TBE Ethidium bromide (EtBr) solution (5mg/L) Water (DNase- and RNase-free) 5 PROCEDURA 5.1 Estrarre 150µL di campione con metodo Boom (Appendice 1) o con robot per estrazione MagNAPure (Consultare la Procedura Operativa Standard VSOP 36 Procedura automatizzata del Robot Magna Pure LC Roche per estrazione automatizzata di acido nucleico). *Consultare - Informazioni utili. 5.2 Preparare una quantità di mix reverse transcription (RT), ad esempio per 12 provette: 48µL 10x PCR buffer (Gibco; minus MgCl 2 ) 72µL 50mM MgCl 2 72µL dntp 4.8µL random hexamer mix 4.8µL RNasin 12µL MMLV RTase Dispensare aliquote di 17.8µL in provette da 0.5mL Oppure: 5.3 Preparare una reverse transcription mastermix (Appendice 2) 5.4 Aggiungere 22.2µL di eluato RNA dal punto 5.1 alla RT mix dal punto 5.2 o Incubare 10 minuti a temperature ambiente, 45 minuti in bagno ad acqua a 37 C, 5 minuti a 100 C e poi raffreddare su ghiaccio 5.6 Preparare una quantità di primary PCR mix, ad esempio per 10 provette; 80µL 10x PCR buffer (Invitogen) 24µL MgCl 2 10µL di ciascuno dei 2 outer primers 673µL acqua 3µL Taq polymerase Dispensare la PCR mix in aliquote di 80µL in provette da 0.2ml 5.7 Aggiungere 20µL RTase mix preparata al punto 5.4 alla primary PCR mix del punto Trasferire le provette in un thermal cycler. Amplificare con le seguenti condizioni di ciclo: Incubare a 94 C per 2 minuti, procedere con 35 cicli a 94 C per 1 minuto, 68 C per 1.5 minuti. Raffreddare i campioni a 15 C. Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 7 di 13

8 5.9 Preparare un ulteriore quantità di PCR mix, ad esempio per 10 reazioni: 50µL 10x PCR buffer 10µL dntp mix 15µL MgCl 2 30µL di ciascuno dei 2 inner primers 342µL di acqua 3µL Taq polymerase Dispensare aliquote di 48µL in provette da 0.2mL 5.10 Aggiungere 2µL di primary PCR mix dal punto Trasferire le provette in un thermal cycler ed amplificare usando le seguenti condizioni: Incubare a 94 C per 2 minuti, procedure con 35 cicli a 94 C per 1 minuto, 60 C per 1 minuto, 72 o C per 1 minuto. Raffreddare i campioni a 15 C Prelevare 15µL di amplificato, aggiungere 1.5µL 10x tracking dye ed analizzare su gel di agarosio 2% 5.13 Al termine dell elettroforesi, colorare per minuti i gel in ETBR solution Lavare il gel con 1x running buffer, visualizzare con U.V a corta lunghezza d onda. Gli amplificati dei virus influenzali A sono di 413bp (Consultare Appendice 3). *INFORMAZIONI UTILI Ogni laboratorio deve elaborare una valutazione del rischio sul campione(i) da analizzare che si ritiene possa contenere virus influenzali A H5 prima della suddivisione in aliquote per l estrazione con tampone di lisi. Il rapporto tampone di lisi e campione è minore nell estrazione eseguita con MagNAPure rispetto a quella manuale di Boom. Il rapporto più ridotto fra tampone di lisi e campione può non essere sufficiente ad inattivare i virus influenzali A a concentrazioni elevate. 6 LABORATORIO DI RIFERIMENTO Inviare per conferma i campioni positivi per virus influenzali A al Respiratory Virus Unit, Cfl, Colindale. 7 SEGNALAZIONE ALLA HPA 9 (LOCALE ED AI SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO PER LE INFEZIONI) Ogni risultato positivo per infezione da questo microrganismo deve essere immediatamente segnalato per garantire che sia intrapreso un appropriato intervento per la tutela della salute pubblica. La linea guida sulla procedura attuale di refertazione di questa infezione è disponibile sul sito web dell HPA Qualsiasi richiesta sulla procedura di refertazione, o di qualsiasi altra condizione inerente problemi di salute pubblica deve essere discusso in prima istanza con la locale Health Protection Unit (HPU). Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 8 di 13

9 8 CONTATTI Dr Joanna Ellis Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department, HPA, Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT. Tel: Joanna.Ellis@hpa.org.uk Dr Alison Bermingham Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department, HPA, Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT. Tel: Alison.Bermingham@hpa.org.uk Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 9 di 13

10 APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR A1.1 REAGENTI Tampone L6 Tampone L2 Sospensione di silice Etanolo (70%) Acetone Acqua priva di RNasi RNasin (40,000U/mL) A.1.2 PROCEDURA A Aggiungere 10µL di sospensione di silice a 840µL di tampone L6, in una provetta da 1.5mL A Aggiungere 150µL di campione A Passare su Vortex per 5 secondi, mettere poi su agitatore a temperature ambiente per 10 minuti A Centrifugare per 15 secondi, scartare il sopranatante A Aggiungere 1mL di tampone L2, passare su vortex, centrifugare per 15 secondi e scartare il sopranatante A Ripetere A1.2.5 A Ripetere A.2.5 con etanolo 70% al posto di tampone L2, due volte A Ripetere A1.2.5 acetone al posto di etanolo, una volta A.1.2,9 Asciugare i campioni per 10 minuti a 56 C, con coperchi aperti A Aggiungere 30µL di acqua priva di RNasi contenente 1µL di RNasin e passare su vortex per 5 secondi. A.2.11 A.2.12 Eluire l acido nucleico a 56 C per 10 minuti. Passare su vortex e centrifugare per 5 minuti. A.2.13 Raccogliere l eluato con attenzione, non contaminare con silice. NOTA TECNICA I residui di silice trasferiti alla fase successiva possono inibire l attività della transcrittasi inversa. Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 10 di 13

11 APPENDICE 2. PREPARAZIONE DELLE REVERSE TRANSCRIPTION MASTERMIXES A2.1 REAGENTI 10x PCR tampone (Invitrogen) privo di MgCl 2, per reverse transcription (200mM Tris-HCl; 500mM KCl; ph 8.4) 50mM MgCl 2 dntp mix (ciascun dntp a 10mM) Random hexamer mix (0.5ug/µL) RNasin (40,000U/mL) MMLV reverse transcriptase (200U/µL) A2.2 PROCEDURA A2.2.1 Preparazione della Reverse Transcription Mix Preparare una quantità di reverse transcription reaction mix, ad esempio per 13 reazioni: 52µL 10x tampone PCR (Invitrogen; privo di MgCl 2 ) 78µL 50mM MgCl 2 78µL dntp 5.2µL Random hexamer mix Conservare a -20 C fino al momento dell utilizzo Scongelare la reverse transcription mix prima dell utilizzo Aggiungere 5.2µL di RNasin e 13µL di MMLV Rtasi Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Trainig Pagina 11 di 13

12 APPENDICE 3. RICERCHE DI VIRUS INFLUENZALI A CON MATRICE E BLOCK-BASED RT-PCR M = Marker peso molecolare DNA Linea 1 A/Wuhan/359/95 (AH3N2) Linea 2 A/Wuhan/371/95 (AH1N1) Linea 3 A/Swine/Taiwan/7310/70 (AH3N2) Linea 4 A/Swine/OMS/2899/82 (AH1N1) Linea 5 A/Swine/OMS/3633/84 (AH3N2) Linea 6 A/Duck/Germany/1215/73 (AH2N3) Linea 7 A/Duck/Ukraine/1/63 (AH3N8) Linea 8 A/Shearwater/Australia/1/72 (AH6N5) Gli amplificati di Influenza sono di 413bp. Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 12 di 13 Riferimento no: VSOP 42i2

13 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Ellis JS, Zambon MC. Combined PCR-heteroduplex mobility assay for detection and differentiation of influenza A viruses from different animal species. J Clin Microbiol 2001;39: Advisory Committee on Dangerous Pathogens 2004 Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; Health Protection Agency. Laboratory reporting to the Health Protection Agency. Guide for diagnostic laboratories Revisione no: 1.2 Data di revisione Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards and Training Pagina 13 di 13 Riferimento no: VSOP 42i2 Questo MNS deve essere usato congiuntamente agli altri MNS emessi dalla Health Protection Agency