Anamnesi Sintomi Lesioni. Diagnosi. Il ricorso agli esami di laboratorio è enormemente ingigantito, in particolare per la diagnosi virologica

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1 Silvio Pascucci 1

2 Anamnesi Sintomi Lesioni Esami : Istologici Virologici Sierologici Diagnosi Il ricorso agli esami di laboratorio è enormemente ingigantito, in particolare per la diagnosi virologica 2

3 Tecniche diagnostiche virologiche agli inizi degli anni 50 Trasmissione ad animali sensibili Esame istologico Ultrafiltrazione (candele e filtri colloidali) Ultracentrifugazione Microscopia elettronica ai primi passi Elettroforesi Isolamento su uovo embrionato (non SPF) Emagglutinazione e HI per Malattia di Newcastle Virusneutralizzazione 3

4 Evoluzione delle tecniche diagnostiche virologiche dal 1950 ad oggi Immunofluorescenza diretta e indiretta Colture cellulari primarie e continue Dopo 1980 ELISA (1983) Agar-gel precipitazione e immunodiffusione Sequenziamento nucleotidico (1975) Anticorpi monoclonali (1975) Enzimi di restrizione - RFLP (1985) Sonde nucleari (1987) PCR (1986) RT-PCR (1988) Real time RT-PCR (1993) Microarray (1995) Pirosequenziamento (2002) e UHTS MassTag PCR, GreeneChip (2005) 4

5 Tecniche molecolari sul virus della Malattia di Newcastle Sonde patotipo specifiche Digestione con Enzima Alu I per distinguere i ceppi vaccinali o con altri enzimi (RFLP) Sonde fluorogeniche TaqMan PCR-Elisa Sequenziamento RT-PCR F2 Peptide di connessione F1 Real time RT-PCR quantitativa

6 Diagnostica multipla con Greene VrdB sequenze virali 1710 virus sequenze batteriche 135 batteri 4109 sequenze micotiche 73 miceti 2626 sequenze parassitarie 63 parassiti sequenze 7 cm 2 cm Microarray diagnostico per virus di interesse veterinario 2884 Sequenze 308 specie virali 36 famiglie 6

7 Evoluzione delle tecniche diagnostiche virologiche negli ultimi venti anni PCR RT-PCR Real time RT-PCR MassTag PCR Sonde Microarray GreeneChip Sequenziamento Pirosequenziamento UHTS 7

8 Sierotipi, Sottotipi e varianti (tipizzazione fenotipica) Genotipi e (tipizzazione genomica Sottogenotipi alberi filogenetici) Patotipo Immunotipo (tipizzazione in base alla virulenza e diffusibilità) (tipizzazione in base al potere immunogeno) Eziologia multipla La quasispecie

9 Fattori esterni influenti sulla evoluzione della diagnostica in patologia aviare Trasformazione dell allevamento avicolo come dimensioni, struttura e conduzione Selezione genetica dei soggetti allevati Cambiamento nelle condizioni ambientali (clima, trasporti, sovraffollamento, uccelli selvatici) Politiche zootecniche europee e diminuita disponibilità di denaro pubblico a partire dagli anni 80 9

10 Diagnosi D allevamento Sanitaria - Epidemiologica Per la ricerca Veterinario d azienda Veterinario pubblico Università, Istituti, Industria farmaceutica 10

11 La diagnostica virologica in patologia aviare con tecniche molecolari appare: rapida, precisa, economica, semplice per l esecuzione automatizzata utilissima per l epidemiologia e per la ricerca di base complessa per il risultato e non sempre di facile interpretazione e di immediata utilità pratica per l allevatore 11

12 La diagnostica molecolare presenta due principali rischi: 1) che il veterinario si affidi ciecamente ad essa, dimenticando gli aspetti anamnestici, clinici e anatomici! 1) che favorisca l aumento del gap tra allevamento e istituzioni pubbliche, tra ricerca applicata e ricerca di base! 12

13 Dobbiamo allora rimpiangere la diagnostica di un tempo? Certamente no!!! 13

14 1. interpretare al meglio e con senso critico i risultati delle tecniche moderne, 2. non dimenticare i principi base della diagnostica, 3. avere occhio sempre attento ai problemi pratici dell allevamento.

15 Stupore Curiosità 15

16 .and each new problem would require a new crusade, and each new crusade would leave fresh problems for yet further crusades to solve and multiply in the good old way. (Aldous Huxley, Time must have a stop) 16

17 Sempre caro mi fu quest ermo colle E questa siepe, che da tanta parte De l ultimo orizzonte il guardo esclude. 17