FilmArray system versus RT-PCR method in meningitidis and sepsis management: an example of routine-emergency integration

Transcript

1 FilmArray system versus RT-PCR method in meningitidis and sepsis management: an example of routine-emergency integration Relatore: D.ssa Loria Bianchi, PhD U.O. Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche- Sezione Microbiologia, Ospedale S.Jacopo, Pistoia 14 ottobre, 2014

2 Elenco dei microrganismi responsabili di meningiti acute

3 Rapidità della diagnosi di meningite e prognosi del paziente Meningite batterica Postumi come sordità, cecità, paresi, ritardo mentale sono caratteristici delle forme batteriche ed assenti in quelle virali Meningite virale Meno gravi delle forme batteriche, di regola a decorso acuto, con risoluzione completa della sintomatologia Haemophilus influenzae tipo b: bassa mortalità (3%) ma causa di deficit intellettivi in oltre il 30% dei bambini colpiti Meningite pneumococcica: alto tasso di letalità (12%), ma solo raramente lascia esiti nei sopravvissuti Sono a liquor limpide, asettiche, iniziano con una pleiocitosi con presenza di PMN, seguita poi da aumento di linfociti Più alta incidenza nei bambini e giovani adulti. Diagnosi: importante per escludere una meningite batterica

4 ALGORITMO DIAGNOSTICO BASATO SUL RISULTATO DELL ESAME CHIMICO FISICO Meningite batterica Aspetto: torbido Globuli bianchi /µl Neutrofili % > 80% Glucosio < 34 mg/dl R glu liquor /glu siero 0.23l Meningite virale Aspetto: limpido Linfomonociti / µl Glucosio mg/dl R glu liquor /glu siero >0.4 In presenza di cellularità liquorale > Leucociti/mm 3 le caratteristiche dell esame chimico-fisico hanno un VPP di meningite infettiva maggiore dell 80% ( 3% dei casi)

5

6 VPP DELL ESAME CHIMICO-FISICO IN PRESENZA DI LIEVE E MODERATA PLEIOCITOSI In presenza di un liquor : Limpido Incolore Lieve e moderata pleiocitosi: Leucociti/mm 3 : 27% dei casi totali (65/240) Prevalenza di PMN (> 60%) si esegue pannello batterico e successivamente pannello virale (12% dei casi) Prevalenza di cellule mononucleate (> 80%) si esegue il pannello virale (15% dei casi ) Presenza di pleiocitosi con PMN < 60% e cellule mononucleate < 80%) viene eseguito si il pannello virale che quello batterico (73% dei casi)

7 Obiettivi Valutare: 1. sensibilità e specificità della tecnologia FilmArray (TFA: applicazione off label della metodica) su LCR rispetto alle metodiche «tradizionali» e all RT-PCR 2. il valore predittivo negativo (VPN) della RT-PCR e della tecnologia TFA su campioni di liquor, sangue e liquidi cavitari (pleurico, peritoneale, pericardico, articolare) con validazione clinica della metodica 3. l efficacia nella gestione della sepsi calcolando il Turn Around Time (TAT) rispetto alle metodiche tradizionali

8 Casistica 240 campioni di LCR raccolti dal campioni di sangue raccolti dal liquidi cavitari Metodologia impiegata Esame chimico fisico LCR : valutazione macroscopica: volume, aspetto, colore valutazione microscopica: conta delle cellule e differenziazione Esami biochimici (liquor/siero) ed ematologici: glicemia, elettroliti (Na, K, Cl), enzimi epatici (transaminasi, gamma-gt, etc), proteine totali, albumina, emocromo, PT, PTT; Esami microbiologici: estrazione degli antigeni solubili, esame colturale (piastre di agar cioccolato e sangue, etc in CO 2 ), emocoltura (Becton Dikinson) Esami molecolari: Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCT) Tecnologia FilmArray (TFA)

9

10 Tecnologia FilmArray

11

12 Microrganismi e fattori di resistenza valutati con TFA e RT-PCR su LCR e sangue

13 N patogeni rilevati CONFRONTO TRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEI LIQUOR 12 LIQUOR Antigeni solubili Batterioscopico Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA N. Sensibilit N. N. Sensibilit N. Sensibilit N. Sensibilit N. Sensibilit Sensibilità casi à casi casi à casi à casi à casi à 10 N. meningitidis 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 1 33,33% 3 100,00% 1 33,33% L. monocytogenes ,43% 4 57,14% 5 71,43% 7 100,00% 4 57,14% E. coli 0 0,00% 1 25,00% 1 14,29% 2 28,57% 4 100,00% 3 75,00% 8S. pneumoniae 5 45,45% 5 45,45% 5 71,43% 5 71,43% ,00% 8 72,73% H. influenzae 1 20,00% 1 20,00% 2 28,57% 1 14,29% 5 100,00% 3 60,00% K. pneumoniae ,00% 0 0,00% 1 100,00% 1 100,00% 1 100,00% Streptococco 6 gruppo B 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 100,00% 0 0,00% Totale positivi 7 29,17% 13 40,63% 13 40,63% 15 46,88% % 20 62,50% 4 VPP 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% VPN 89,27% 91,63% 91,63% 92,44% 100,00% N. meningitidis L. monocytogenes E. coli S. pneumoniae H. influenzae K. pnuemoniae Streptococco gruppo B Antigeni solubili Batterioscopico Gram Colturale liquor Emocoltura RT-PCR TFA

14 CONFRONTO FRA METODICHE: NUMERO DI PATOGENI RILEVATI NEL SANGUE

15 SENSIBILITÀ E VPN DELLE METODICHE PER LA RICERCA DI PATOGENI NEL SANGUE RISULTATI SANGUE Emocoltura RT-PCR TFA Patogeno N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità N. casi Sensibilità N. meningitidis 1 50,00% 2 100,00% 1 50,00% S. pneumoniae 7 87,50% 8 100,00% 3 37,50% H. influenzae 4 80,00% 4 80,00% 1 20,00% E. coli 6 85,71% 5 71,43% 2 28,57% K. pneumoniae 2 100,00% 1 50,00% 1 50,00% S. agalactiae 3 100,00% 3 100,00% 1 33,33% C. albicans 2 100,00% ,00% C. parapsilosis 1 100,00% ,00% Enterococco 5 100,00% ,00% S. aureus 8 100,00% 8 100,00% 4 50,00% S. marcences 1 100,00% ,00% P. aeruginosa 7 100,00% 7 100,00% 4 57,14% A. baumannii 1 100,00% ,00% S. capitis 1 100,00% P. mirabilis 2 100,00% ,00% Salmonella spp ,00% Totale positivi 52 92,86% 38 67,86% 24 42,86% Totale germi rilevabili 56 92,86% 42 90,48% 54 44,44% VPN 96,88% 87,32% 79,49%

16 CONCLUSIONI (1) Su LCR, la RT-PCR è la metodica più sensibile (sensibilità e VPN del 100%); inoltre, rilevando il patogeno nella matrice primaria (LCR/sangue) si riduce il TAT (2h e 20 ) rispetto all esame colturale e all emocoltura. Su sangue, l emocoltura è la metodica più sensibile (92,86%) con il più elevato VPN (96.88%) e rimane il «gold» standard nella gestione della sepsi. L RT-PCR è di grande aiuto per la rapidità di risposta (TAT= 2h e 20 min) anche se ha il limite del ridotto numero di patogeni rilevabili Su sangue, la TFA deve incrementare la resa estrattiva per aumentare sensibilità (42.66%) e VPN (44.44%) non adeguati per il management della sepsi.

17 CONCLUSIONI (2) Su LCR la TFA ha sensibilità più elevata (65%) rispetto al batterioscopico Gram ed estrazione degli antigeni solubili. La facilità di allestimento (2-4 min operatore), di interpretazione del test e il suo TAT di 1h la rendono, quindi, la tecnica più efficace nella gestione del liquor in urgenza

18 PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA ESAME CHIMICO-FISICO LCR Negativo Positivo Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37 C; CO 2 )* Gram** FilmArray (Pannello BCDI) Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37 C; CO 2 )* Gram** FilmArray (Pannello BCDI) Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza routine rapida (entro ore 12 del 1 gg feriale) Negativo Positivo??? Pannello batterico Pannello virale: HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster * in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiologia **colorato e refertato entro le ore 12 del 1 gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)

19 Collaboratori Dr. Roberto Giannecchini Dr. Fabiano Santoni Dr. Roberto Toscano Dr. Leonardo Rizzi D.ssa Rosalba Gori D.ssa Cappelli Donatella D.ssa Margherita Niccolai D.ssa Patrizia Lencioni Un grazie particolare a: D.ssa Zaleida Napoli Dr. Swan Donati Dr. Riccardo Lari: Responsabile Area Diagnostica di Laboratorio Grazie anche a tutto il personale tecnico della microbiologia e non solo!!

20

21 PERCORSO DIAGNOSTICO NEL SOSPETTO MENINGITE INFETTIVA ESAME CHIMICO-FISICO LCR Negativo Positivo Estrazione degli antigeni solubili* Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37 C; CO 2 )** Gram*** Estrazione degli antigeni solubili* Esame colturale su piastre agar cioccolato e sangue (37 C; CO 2 )** Gram*** Approfondimento diagnostico con metodica RT-PCR in regime di urgenza routine rapida (entro ore 12 del 1 gg feriale) se LCR festivo/notturno Pannello batterico: N.meningitidis S.pneumoniae L. monocytogenes E.Coli S-agalactiae H.Influenzae K.pneumoniae Pannello virale: *RT-PCR batterico se LCR arrivato festivo/notturno ** in flaconi da emocoltura e processati in automatico nelle ore di chiusura della microbiolobia ***colorato e refertato entro le ore 12 del 1 gg feriale dal microbiologo RT-PCR pannello batterico e virale (vedere richiesta clinica ed esame chimico-fisico)??? Pannello batterico HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-7 CMV EBV Parechovirus Enterovirus Varicella zoster

22 Sensibilità delle metodiche colturali e molecolari per la ricerca di patogeni nei liquidi cavitari Casi positivi rilevati con: LIQUIDI CAVITARI ESAME COLTURALE RT-PCR TFA Liquidi peritoneali (n=4) E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa Liquidi pleurici (n=4) S. pneumoniae K. pneumoniae (KPC) H. influenzae Liquidi articolari (n=1) S. aureus Totale positivi Sensibilità 77,78% 100% 66,67%

23 Kit Produttore Patogeno Target bp ctra (capsule polysaccharide N. meningitidis export outer membrane - protein) EusepScreen Adulti Eurospital S. pneumoniae H. influenzae lyta (N-acetomuramoyl-Lalanine amidase) bexa (involved in the synthesis of the polysaccharide capsule structure) Adenovirus L4 (hexon assembly protein) K. pneumoniae phoe (outer membrane phospoporin protein E) - EusepScreen Lattanti HSV1 HSV2 VZV R- gene Eurospital Argene E. coli uidb (glucuronide transporter) - S. agalactiae sip (streptococcal surface immunogenic protein) - L. monocytogenes iap (invasion associated protein) - HSV1 US7 116 HSV2 US2 123 VZV gp ENTEROVIRUS R- gene Argene Enterovirus 5' UTR 146 CMV ppul CMV HHV6,7,8 R- HHV6 U Argene gene HHV7 U HHV8 ORF EBV R-gene Argene EBV BXLF1 (thymidine kinase) 169

24