COMET ASSAY ALCALINO (Single Cell Gel Electrophoresis)

Transcript

1 COMET ASSAY ALCALINO (Single Cell Gel Electrophoresis) NORMAL GEL AGAROSE (1%): - SOLUZIONI (Preparazione e Conservazione) - 1,071g in 100ml di PBS > si fanno sciogliere in agitazione a C. Conservare a T ambiente e risciogliere il gel ogniqualvolta si preparano dei vetrini con 1 strato. Utilizzare al massimo per 2-3 volte. LOW GEL AGAROSE (0,7%): 0,15g in 20ml di PBS > si fanno sciogliere in agitazione a C. Conservare il gel a 37C in incubatore per al massimo un paio di mesi. SOLUZIONE MADRE DI LISI (ph = 10): In 200ml di H 2 Od 29,22g di NaCl (2,5 M) 7,44g di Na 2 EDTA (100mM) 0,24g di Tris-HCl (10mM) 1,6g di NaOH A seconda dell utilizzo si può preparare anche un volume di 100ml, dimezzando le quantità. La soluzione va piaccata dopo avere sciolto le sostanze tramite agitazione magnetica. Sicuramente ci sarà bisogno di aggiustare il ph attraverso l utilizzo di HCl ed NaOH 1M. La soluzione può essere conservata a T ambiente. Al momento dell utilizzo va aggiunto l 1% in volume di Triton X-100 e il 10% di DMSO. BUFFER PER LA CORSA ELETTROFORETICA (ph = 13): In 4l di H 2 Od 1,48g di Na 2 EDTA (1mM) 48g di NaOH (300mM) A seconda dell utilizzo si può preparare anche un volume di 2l, dimezzando le quantità. La soluzione va piaccata dopo avere sciolto le sostanze tramite agitazione magnetica. Sicuramente ci sarà bisogno di aggiustare il ph attraverso l utilizzo di HCl ed NaOH 1M. La soluzione va conservata a +4C (camera fredda). 1

2 SOLUZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE (ph = 7,5): In 20 ml di H 2 Od 1,26g di Tris-HCl (0,4M) La soluzione va piaccata dopo avere sciolto le sostanze tramite agitazione magnetica. Sicuramente ci sarà bisogno di aggiustare il ph attraverso l utilizzo di HCl 1M. La soluzione va conservata a +4C. In alternativa è possibile preparare 500ml di soluzione madre, da conservare a T ambiente, sciogliendo 31,5g di Tris, aggiustando il ph ad ogni utilizzo, prendendo un aliquota e conservandola a +4C. SOLUZIONE DI BROMURO DI ETIDIO: 1mg di EtBr in 10ml di H 2 Od (stock solution) ---> diluizione 1/10 (1 ml di stock in 9ml di H 2 Od) - PREPARAZIONE DEI VETRINI CON PRIMO STRATO DI GEL - 1) Prendere un buon numero (20-30) di vetrini molati portaoggetto, con banda colorata, ed immergerli in un contenitore, possibilmente di metallo, contenente Metanolo freddo. Fare in modo di immergere i vetrini a ventaglio e con la parte molata rivolta verso l alto, per evitare che attacchino uno con l altro e rendano difficoltoso il recupero. 2) Lasciare i vetrini in Metanolo freddo, a + 4C, per 50min-1h. 3) Nel frattempo preparare il NORMAL GEL o scioglierlo se già lo si è preparato. 4) Recuperare i vetrini dal contenitore con Metanolo tramite una pinzetta ed asciugarli all aria, possibilmente su di un vassoio con della carta assorbente. Assicurarsi che i vetrini siano orientati con la parte molata verso l alto. 5) Sciolto il NORMAL GEL, abbassare un poco la T, tenendo la beuta sotto il getto d acqua. 6) Versare il NORMAL GEL in una o più vaschette porta vetrini (coplin). 7) Recuperare dal vassoio i vetrini asciutti con una pinzetta. 8) Immergere i vetrini nella vaschetta e lasciarli il tempo necessario affinchè il gel non sia quasi solidificato. 9) Recuperare i vetrini dalla vaschetta con una pinzetta e metterli ad asciugare sullo stesso vassoio utilizzato in precedenza. I vetrini saranno utilizzabili per il COMET il giorno dopo. 2

3 - PREPARAZIONE CELLULE PER COMET A] Cellule in coltura: Una volta staccate le cellule con tripsina (se aderenti) e contate, si effettua un lavaggio in PBS - - (1000 rpm per 5min a C) ---> le cellule vanno risospese in PBS - - (in 20μl circa dobbiamo avere circa 20mila cellule). E indispensabile, quindi, effettuare delle prove su vetrino per vedere se si raggiunge la giusta densità. B] Linfociti isolati: A prescindere dal metodo utilizzato per l isolamento, si procede nello stesso modo delle cellule in coltura, assicurandosi dopo lavaggio in PBS - -,di avere la giusta densità cellulare sul vetrino (in 20μl circa dobbiamo avere circa 20mila cellule). Nel caso di linfociti scongelati* il procedimento è il medesimo, salvo il fatto che si conosce già il numero delle cellule per fiala e/o per ml. * I linfociti, tenuti a 80 C, possono essere utilizzati per il COMET, al massimo entro un mese dal congelamento. C] Sangue intero: Il sangue intero e/o buffy coat può essere utilizzato direttamente per il COMET, senza bisogno di isolare i leucociti dal resto dei componenti. Solitamente, però, si prelevano soltanto 10-15μl di sangue (nel caso di buffy coat anche di meno --> 8-12μl) da mettere sul vetrino, in modo di avere una più che buona densità cellulare. - VITALITA CELLULARE - Nel caso di cellule in coltura e di linfociti isolati (congelati e freschi ), è importante osservarne la vitalità per ogni punto sperimentale (controlli e trattati), subito prima di iniziare il COMET, e dopo avere stabilito la giusta densità cellulare. Solitamente la conta di cellule morte si effettua con il TRYPAN BLUE: 90μl di sospensione cellulare + 10μl di T.B. X 3min (oppure 40μl di sospensione cellulare + 5μl di T.B. X 3min) ---> si contano 100 cellule ---> rapporto tra cellule morte (di colore blu) e cellule vive (doppia conta). Per i linfociti congelati la vitalità va osservata anche prima del congelamento, per vedere se il mantenimento a basse T per un certo periodo di tempo influisce su questo parametro. - Nel caso del sangue intero (trattato e non) è possibile determinarne la vitalità attraverso un breve passaggio di lisi degli eritrociti, che si effettua utilizzando una particolare soluzione. SOLUZIONE DI LISI CON CLORURO DI AMMONIO (10X): Per 50ml di H 2 0d (utilizzare una falcon da 50ml con tappo blu per l eventuale conservazione) 4,01g di NH 4 Cl (1,5M) 0,42g di NaHCO 3 (100mM) 0,185g Na 2 EDTA (10mM) ---> 40ml di H 2 0d Piaccare (aggiustando con HCl ed NaOH 1M) ----> ph = 7,4 ---> aggiungere H 2 0d per arrivare a 50ml 3

4 In teoria è possibile conservare la soluzione 10X al massimo per 6 mesi a +4 C, ma da precedenti test, la cosa migliore è preparare la soluzione fresca ogni volta. La soluzione di utilizzo è 1X (diluizione 1:10) e va tenuta su ghiaccio prima dell uso. La soluzione viene usata, sostanzialmente, per lisare gli eritrociti. Non conservare mai la soluzione di lisi ad una concentrazione minore di 10X, altrimenti potrebbe formarsi carbonato di ammonio, rendendola inutilizzabile. La procedura di utilizzo della soluzione di lisi è la seguente: 1) Mettere 200μl di sangue intero in un tubo da centrifuga (falcon da 15ml con tappo blu) ed aggiungere 3ml di soluzione di lisi 1X. Incubare per 10min a T ambiente. 2) Centrifugare 5min a 1500 rpm, a T ambiente (20-25 C). 3) Eliminare il sopranatante. Risospendere le cellule in 2 ml di PBS - -. Centrifugare 5min a 1500 rpm, a T ambiente. 4) Eliminare il sopranatante e ripetere il lavaggio con PBS ) Risospendere le cellule a seconda dell utilizzo (nel caso della determinazione della vitalità, a questo punto si procede come per i linfociti o le colture cellulari). - PREPARAZIONE DEI VETRINI CON SECONDO STRATO DI GEL SOSPENSIONE CELLULARE - - Etichettare i vetrini con il primo strato di gel scrivendo con un pennarello sulla fascia colorata. Mettere i vetrini, tanti quanti sono i punti sperimentali (se la camera elettroforetica lo permette, preparare due vetrini per ogni punto sperimentale), su di un vassoio a +4 C (frigo). Una volta ottenute le giuste sospensioni cellulari, con la giusta densità (vedi sezione precedente), preparare tante eppendorf da 1,5ml quanti sono i punti sperimentali ed etichettarle. Prelevare 20μl di sospensione cellulare per ogni punto (nel caso di sangue intero o buffy coat 8-15μl) e metterli nelle corrispondenti eppendorf. Prendere il LOW GEL dall incubatore e dei vetrini coprioggetto (24x60mm). Togliere i vetrini da +4 C. Con una P200, prelevare 180μl di LOW GEL per ogni punto, metterli nell eppendorf, portare a 200 la pipetta e spipettare la sospensione così ottenuta. Prelevare i 200μl e distribuirli sul vetrino corrispondente cercando di evitare la formazione di bolle (anche nel caso di sangue intero e di buffy coat, il volume totale deve essere di 200μl). Mettere il vetrino coprioggetto. Questa operazione va fatta abbastanza velocemente per impedire la solidificazione del gel. Una volta terminata l operazione mettere i vetrini di nuovo a +4 C per 20-30min, affinchè il gel si solidifichi. - LISI CELLULARE - - Una volta che la sospensione cellulare con il gel sia solidificata, prendere 100ml di soluzione di lisi (vedi la preparazione di soluzioni per il COMET), ed immergerci i vetrini per 50min-1h a +4 C (frigo). Nel frattempo preparare in camera fredda (+4 C) la cella elettroforetica. - UNWINDING - - Finita la lisi cellulare, prendere il vassoio con i vetrini dal frigo e portarlo in camera fredda. Munirsi di pinzette e di carta assorbente. Prendere i vetrini dal vassoio, asciugare la parte inferiore con la carta assorbente e porli sulla cella elettroforetica. Infine immergere i vetrini nel buffer di 4

5 corsa, tenuto preventivamente a +4 C in camera fredda, per 15-20min. Questa operazione, detta di unwinding, permette lo svolgimento ed il rilassamento della doppia elica del DNA. - CORSA ELETTROFORETICA - - Terminata la fase di unwinding, è possibile far cominciare la corsa elettroforetica. I parametri di corsa sono 300mA, 25V per 15min. La corsa va effettuata in camera fredda, a +4 C, possibilmente al buio. Prima di far partire il tempo, aggiustare la quantità di buffer per raggiungere i parametri suddetti. - NEUTRALIZZAZIONE E FISSAGGIO - - Terminata la corsa elettroforetica, recuperare i vetrini dalla cella con una pinzetta e porli su di un vassoio per la fase successiva che può essere compiuta a T ambiente. Prendere la soluzione di neutralizzazione (vedi la preparazione di soluzioni per il COMET) dal frigo. Con una pipetta pasteur prelevare dei volumi di soluzione di neutralizzazione e spargerli sui vetrini. Lasciare agire la soluzione per 5min a T ambiente. Questa fase è importante per abbassare il ph, ed impedire l ulteriore rilassamento della doppia elica del DNA. - Passati i 5min, prelevare i vetrini con una pinzetta ed asciugare la parte inferiore con della carta assorbente. Immergere i vetrini in una vaschetta (coplin) contenente metanolo freddo (solitamente contenuta a + 4 C), e lasciarli per 3min. Terminata questa fase, lasciare asciugare i vetrini all aria su di un vassoio. Passate 24h sarà possibile leggere i vetrini. Questa fase è detta di fissaggio. - COLORAZIONE DEI VETRINI E LETTURA - - Accendere la lampada a fluorescenza del microscopio, facendo attenzione che sia impostato il filtro n 2 (per la fluorescenza rossa). Il filtro può essere cambiato agendo sulla ruota nella parte superiore del microscopio. Inserire la spina relativa alla fotoocamera presente sul microscopio. Accendere il PC, entrando nel BIOS, e cambiando le impostazioni relative alla porta parallela (da 3 e qualcosa a 2 e qualcosa). - Aprire il programma, per l analisi e cattura di immagine, IAS 2000 (Delta Sistemi) *. - Prelevare con una pipetta 90μl di EtBr 1:10 (tenuto a +4 C) e spargerlo sul vetrino che dobbiamo leggere. Porre sul vetrino un vetrino coprioggetto(24x60mm). Asciugare bene i bordi del vetrino, togliendo l eccesso di EtBr. A questo punto è possibile cominciare a leggere il vetrino. * Per il funzionamento del software si rimanda al manuale utente, presente nel faldone relativo ai protocolli.. 5

6 APPENDICE 1 USO SOFTWARE IAS 2000* - Cliccare su IAS > Moduli addizionali --> Misura Comete. - Per creare una sessione: andare sul riquadro in basso a destra, e cliccare sul pulsante Creare una nuova sessione (ad es. COMET 1) e poi assegnarele una directory (ad es. C:\COMET 1). Cliccare sul pulsante Conferma (a forma di visto). Se la directory non esiste verrà chiesto se vogliamo crearla --> cliccare sul Si. A questo punto cliccare sul pulsante Caricare una sessione --> scegliere dal menu a scelta la sessione appena creata con la relativa directory e cliccare sul pulsante a forma di visto - Cliccare sul pulsante a forma di videocamera --> a questo punto si possono acquisire le immagini. - Per acquisire le immagini cliccare su Freeze e poi su Ok. - Nella prima immagine acquisita stabilire la soglia (--> stabilisci il valore [MAX --> al massimo valore; MIN --> tre 38 e 42; Colore --> giallo o rosso] e poi clicca su applica). Inoltre Checkare la casella Soglia privata. - Nominare ogni immagine in modo da numerare i vetrini che si stanno leggendo --> dopo avere impostato la soglia, cliccare sul pulsante Nuova Immagine --> apparirà una finestra in cui scriveremo il nome del vetrino (che solitamente corrisponde ad un punto sperimentale). Spuntare la voce Autoincremento. - Acquisire nuclei-comete per vetrino-punto sperimentale. Non sovraccaricare la sessione (al max immagini). - Una volta terminata la lettura, tornare alla prima immagine e cliccare sul pulsante Cattura --> processo di cattura automatica delle comete. Abilitare l opzione Ripetitivo per proseguire con la cattura delle comete dell immagine successiva fino ad arrivare all ultima immagine disponibile. Con questa operazione sarà possibile effettuare delle modifiche (Eliminazione, Delimitazione e Taglio) delle comete catturate al fine di scartare quelle immagini che non rispondono alle caratteristiche specificate (dimensioni e soglia). - Raggiunta la fine della sessione, cliccare sul pulsante Misura Comete ---> apparirà, dopo un breve lasso di tempo, la lista con i risultati relativi ad ogni cometa catturata. Con questa operazione sarà possibile eliminare le comete non idonee, spostare la testa dove necessario, etc. Terminata questa fase, chiudere la finestra e cliccare sul pulsante Salva. I risultati vengono salvati in un file in formato.dif, compatibile con i fogli elettronici (Excel), Nominare il file e salvarlo nella directory corrispondente alla nostra sessione. * Per informazioni approfondite sul software si rimanda al manuale utente, presente nel faldone relativo ai protocolli.. 6

7 APPENDICE 2 MODIFICA FOGLIO DI LAVORO EXCEL CON DATI COMET* - Aprire il file con i dati salvati con Excel, salvando il file in formato.xls (cartella di lavoro excel). - Eliminare la colonna con etichetta ID e la seconda riga (vuota). - Spaziare i vari punti sperimentali (corrispondenti a singoli vetrini) con delle righe vuote. - Aprire un file, con dati per il comet, precedentemente elaborato, e copiare la sequenza numerica (prima colonna) da 1 a 50. Incollare questa sequenza nel file che si sta elaborando su tutti i punti sperimentali/vetrini. - Copiare, inoltre, la riga con le intestazioni, per tutti i punti sperimentali/vetrini, facendo attenzione a specificare per ogni punto il numero/etichetta del vetrino. - Eliminare tutti i dati che ci sono in più (oltre il 50), dopodichè copiare da un vecchio file elaborato, le varie funzioni (Media, Dev, St, ed Err. St.) ed incollarle sotto ogni punto sperimentale. Controllare se l intervallo presente nelle funzioni è esatto. - A questo punto su di un altro foglio di lavoro copiamo i valori delle medie,delle dev. st. e degli err. st. per ogni punto sperimentale (le cui etichette verranno scritte su di una riga). I parametri considerati saranno (TM Tail Moment; TL Tail Lenght e F.H./F.Tot quantità di DNA nella coda). - Per mettere sottoforma di grafico i dati così organizzati, evidenziare i dati e cliccare, sulla barra degli strumenti, il pulsante Creazione guidata grafico --> dare il titolo al grafico, eliminare la griglia principale, la legenda e cliccare su mostra valore. Terminata la fase di creazione, ed avendo inserito i grafici su di un altro foglio di lavoro, si possono modificare le grandezze dei caratteri, la scala degli assi, etc. (il grafico, naturalmente, può essere modificato anche in base a quali informazioni vogliamo sottolineare --> solitamente si preferisce mostrare i dati con degli istogrammi). - Per inserire le barre dell errore standard, cliccare sugli istogrammi finchè non esce un quadratino al centro --> puntare il puntatore del mouse sul quadratino ed andare su Barra delle Y e su Personalizza. Tornare sul foglio dei risultati ed evidenziare la riga relativa all errore (ripetere l operazione anche per il - se si vuole la doppia barra). Per informazioni approfondite sull utilizzo di Excel, si rimanda a manuali sull argomento o sulla Guida in Linea del programma. 7

8 Esperimento: COMET ASSAY AA8/EM9 H 2 O 2 LMTG AA8 EM9 1 Controllo non trattato 4 Controllo non trattato 2 - H 2 O 2 (2X10-4 M) 5 - H 2 O 2 (2X10-4 M) 3 - H 2 O 2 (10-4 M) 6 - H 2 O 2 (10-4 M) Preparazione H 2 O 2 : H 2 O 2 (soluzione madre 30 v/v) 10-2 M (14 µl in 5 ml di NaCl allo 0,9%) 2X10-4 M (100 µl/5 ml) 10-4 M (50 µl/5 ml) min Unwinding 8