Rai e migrazione delle NSCs

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1 Rai e migrazione delle NSCs IFOM per la scuola Lo Studente Ricercatore 2009 Lucrezia Bertino Liceo scientifico E. Amaldi Biology and signal trasduction of normal and cancer neural stem cells Daniela Osti

2 Le NSCs Sono cellule staminali neuronali: non differenziate, che si autorinnovano e si differenziano sono presenti sia durante lo sviluppo embrionale che nell individuo adulto ZONA SOTTOVENTRICOLARE si trovano nella zona sottoventricolare del cervello e nel giro dentato dell ippocampo GIRO DENTATO

3 Il differenziamento delle NSCs Le NSCs possono autorinnovarsi oppure producono un progenitore. Quest ultimo si differenzierà nell 80% dei casi in astrociti, nel 10-15% dei casi in oligodendrociti e nei restanti casi in neuroni. I primi svolgono un ruolo di supporto per il corretto funzionamento del sistema nervoso, i neuroni sono responsabili della trasmissione dell informazione.

4 La migrazione Durante lo sviluppo, la capacità migratoria è un processo fondamentale per favorire il corretto posizionamento delle nuove cellule in crescita. Nel cervello adulto, le cellule staminali neuronali migrano differenziandosi dalle aree neurogeniche, dove risiedono, verso la loro destinazione finale, per sostituire cellule danneggiate o morte.

5 Rai È una proteina citoplasmatica Ha due isoforme (p 64 e p52) CH2 PTB CH1 SH2 p64 Rai PTB CH1 SH2 p52 Nei neuroni adulti stimola la sopravvivenza quando questi si trovano sottoposti a stress ossidativo

6 Quale è il legame tra NSCs e Rai? La proteina Rai dovrebbe regolare la migrazione delle cellule staminali neuronali. Come fare a scoprirlo? Attraverso un saggio di migrazione eseguito su cellule wild-type (WT) e knock-out (KO). Le WT esprimono la proteina Rai mentre le KO non la esprimono più.

7 Saggio di migrazione Prelevare le cellule dalle colture Metterle all interno di cellette chiamate boyden-chamber Dopo 48 ore dalla semina utilizzare il colorante crystalviolet,il quale mette in risalto le cellule, permettendoci di osservare il risultato

8 Le colture cellulari Le cellule utilizzate per il saggio vengono prelevate da terreni di coltura privi di siero e contenenti fattori di crescita (EGF e FGF-2). Le cellule per l esperimento devono essere singole e quindi le neurosfere,agglomerati sferici di cellule, che si formano dopo alcuni giorni, vanno separate. A B C Le varie fasi di crescita delle NSCs : da cellule singole(a) a neurosfera (B)

9 La composizione delle neurosfere e il loro mantenimento in coltura Le neurosfere sono costituite da NSCs (rosse), da cellule sul punto di morire (gialle) e da cellule differenziate (verdi). Ogni passaggio di coltura permette di eliminare le cellule verdi e gialle. Rimangono solo le NSCs che sono in grado ogni volta di ricreare una nuova neurosfera.

10 La semina nelle boyden-chamber Attraverso le boyden-chamber si valuta la capacità delle cellule di migrare in condizioni particolari: da un terreno senza fattori di crescita a uno che li contiene. Cells in serum-free basal medium without growth factors t nei dar g sr ot c af ht wor g A B Matrigel coating Struttura di una boydenchamber. La parte A non contiene i fattori di crescita, che al contrario sono in B. Le cellule devono passare attraverso una membrana di Matrigel. Nello specifico le WT dovrebbero migrare di più delle KO.

11 ...dopo 48 ore chemoattractant migration Scrape off unmigrated cells fix and stain Terminata la migrazione, le cellule WT dovrebbero trovarsi nelle zona B, mentre la maggior parte delle KO dovrebbe essere rimasta nella zona A. Dopo aver pulito la zona A, si deve versare il colorante crystalviolet, il quale mette in rilievo le cellule presenti nella zona B.

12 Due risultati a confronto Nel caso B (saggio da me effettuato), ogni transwell è diversa da tutte le altre: il risultato non è, quindi, chiaro. Al contrario nel caso A (saggio effettuato dal tutor), la quantità di cellule WT è visibilmente maggiore di quelle KO. A 0/FGF+EGF WT KO B

13 Riassumendo Come si era ipotizzato, la proteina Rai ha un ruolo nella migrazione delle cellule staminali neuronali. La sua assenza non permette il corretto posizionamento delle cellule nel cervello. Per essere totalmente sicuri che il difetto di migrazione sia dovuto alla sua mancanza, si fa esprimere nelle cellule KO il c-dna che codifica la proteina Rai. Quindi, se ne verifica la presenza con un western blot e, successivamente, si ripete il saggio, dal quale dovrebbe risultare che le cellule KO, nelle quali è stato reintrodotto il DNA per Rai, e le cellule WT migrano nello stesso modo.

14 Che cosa è il western blot? É una tecnica che permette di verificare la presenza di una determinata proteina - in questo esperimento, Rai - nelle cellule. Nel caso in questione, si è verificata la presenza non solo di Rai, ma anche della proteina vinculina. Questa deve essere presente in quantità uguali sia in WT che in KO. Il suo valore serve per normalizzare il valore di Rai ottenuto con il western blot. Se l esperimento è avvenuto, la Rai dovrà essere presente anche nelle KO non solo nelle WT.

15 Il risultato I risultati ottenuti dimostrano che le cellule WT e KO sono state efficacemente infettate. Saranno, quindi, il punto di partenza per i successivi studi per dimostrare se l espressione di Rai in cellule KO permette il recupero del fenotipo WT. VINCULINA RAI p64 p52 La dimensione delle bande indica la quantità delle proteine contenute nel campione. Rai è presente in tutte le cellule tranne nelle KO (non infettate).

16 In futuro Una più profonda comprensione del ruolo di Rai nella migrazione delle NSCs potrebbe portare a interessanti scoperte per applicazioni farmacologiche, al fine di combattere la capacità invasiva dei tumori cerebrali. Inoltre, le NSCs, grazie alla loro capacità migratoria, potrebbero essere sfruttate come vettori per fornire farmaci al cervello.

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