STATO DELL ARTE DELLE BIOTECNOLOGIE IN MEDICINA DI LABORATORIO. Date: EDIZIONE 0 (5 Ottobre 2009) EDIZIONE 1 (15 Ottobre 2009)

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1 STATO DELL ARTE DELLE BIOTECNOLOGIE IN MEDICINA DI LABORATORIO Date: EDIZIONE 0 (5 Ottobre 2009) EDIZIONE 1 (15 Ottobre 2009) ORE 14,00 Registrazione dei partecipanti ORE 14,30 La proteomica, una nuova scienza al servizio della clinica (Prof. G. Federici) ORE 15,30 Sequenziamento in ambito virologico (Prof. CF. Perno) ORE 16,30 Microarray: stato dell arte (Prof. S. Bernardini) ORE Coffè break ORE 18,00 Applicazione delle biotecnologie nella diagnostica anatomopatologica (Prof. L.G. Spagnoli) ORE 19,00 Tecnologie molecolari in epoca prenatale (Prof G. Novelli) ORE 20,00 Quiz e Conclusione dei lavori 1

2 Prof. G. Novelli Tecnologie molecolari in epoca prenatale Negli ultimi anni nel campo della genetica e della biologia molecolare si è assistito ad un impressionante accelerazione dell evoluzione tecnologica. Basti pensare che oggi è possibile ottenere in un mese, ed in un singolo laboratorio, l intera sequenza del genoma umano: meno di dieci anni fa questo ha rappresentato un lavoro di dimensioni colossali per l impegno finanziario e lo sforzo organizzativo. Se da un lato i sequenziatori di ultima generazione ci hanno permesso di conoscere la sequenza del DNA umano, dall altro i chip genomici più recenti hanno mostrato che il nostro genoma è ricco di duplicazioni, triplicazioni, delezioni il cui significato funzionale deve ancora essere spiegato. La tecnologia ha permesso di ottenere una mole enorme di dati che adesso sono pronti per essere analizzati ed interpretati. Chiaramente tutte queste evoluzioni hanno delle chiare applicazioni in ambito sanitario e diagnostico anche in epoca prenatale. Quest ultimo aspetto merita un analisi approfondita poiché non sempre, nell ambito della diagnostica prenatale, ad una maggiore sensibilità tecnica corrisponde una maggiore accuratezza diagnostica. Infatti i limiti delle recenti acquisizioni in ambito tecnologico risiedono nelle difficoltà interpretative dei risultati analitici, particolarmente evidenti in assenza del conforto del genotipo, come appunto in epoca prenatale. I progressi tecnologici nel campo della genetica non possono avere un applicazione clinica immediata se prima non abbiamo dati affidabili di riproducibilità tecnica, ed inerenti i tassi di errori analitici. I primi risultati sperimentali dimostrano che molte delle variazioni qualititative e quantitative del nostro genoma non hanno un significato funzionale evidente e pongono enormi problemi interpretativi. I principali aspetti tecnici, scientifici ed etici verranno discussi alla luce dello stato dell arte e dei suoi possibili sviluppi futuri. Prof. CF. Perno Abstract: Il Sequenziamento in ambito virologico Il sequenziamento è il processo che permette di determinare la corretta sequenza nucleotidica di un frammento di DNA, codificante per una determinata proteina d interesse. Ogni modificazione stabile nella sequenza nucleotidica di un genoma è definita mutazione genetica. Le mutazioni determinano la variabilità genetica. Il metodo di sequenziamento attualmente maggiormente utilizzato è basato sul metodo di Sanger (o a terminazione di catena). Questo tipo di sequenziamento necessita di una DNA polimerasi termostabile, uno stampo a singola elica (templato), un innesco specifico (primer), deossinucleotidi, e una miscela di dideossinucleotidi (ddntps), marcati fluorescentemente che bloccano l allungamento. Il sequenziamento del DNA viene sempre più impiegato nella diagnostica medica, soprattutto in campo virologico in quanto consente di rilevare la presenza di mutazioni associate alla resistenza farmacologica, di analizzare regioni specie-specifiche, che consentono la caratterizzazione dei diversi ceppi virali. Dunque il sequenziamento risulta fondamentale ai fini di una corretta diagnosi terapeutica e di un adeguata scelta terapeutica. Prof. Luigi Giusto Spagnoli Applicazione delle biotecnologie nella diagnostica anatomopatologica 2

3 L Anatomia Patologica costituisce la base scientific della medicina moderna. Questa disciplina nacque nel 18 secolo grazie all opera di un grande scienziato italiano: Giovan Battista Morgagni il quale, per primo intuì che gli organi sono la sede delle malattie umane. Nella sua opera magistrale il De sedibus et causis morbo rum per anatomen indagatis Morgagni, attraverso lo studio delle autopsie che egli effettuava sui suoi stessi pazienti, dimostrò l esistenza di una stretta correlazione tra i sintomi delle malattie e le alterazioni strutturali degli organi. E sorprendente come Morgagni, usando gli unici due strumenti allora disponibili, la vista ed il bisturi, produsse un rivoluzionario avanzamento della scienza medica sostituendo la teoria dei quattro umori di Ippocrate con il principio basato sul legame tra causa ed effetto. Tale metodo d'indagine, detto metodo anatomo-clinico, è tuttora il cardine dell'anatomia patologica. Nel secolo scorso lo sviluppo del microscopio e della tecnica istologica fornì all'anatomo-patologo un nuovo, prezioso strumento di lavoro. Non solo egli poteva esaminare gli organi malati ad occhio nudo come nei secoli precedenti, ma anche scegliere dei campioni di tessuto, prepararne sezioni tanto sottili da permettere il passaggio della luce, colorare queste sezioni, ed osservarne la minuta struttura. La tecnica microscopica aumentò le possibilità diagnostiche dell'anatomo-patologo e gli permise di riconoscere e differenziare malattie non identificabili macroscopicamente. Il tedesco Rudolf Virchow sviluppò l'istologia patologica e applicò le sue scoperte alla pratica clinica. L'anatomia patologica in questo modo non serviva più solo per verificare nel cadavere la storia naturale della malattia, ma poteva anche fornire la diagnosi durante la vita del paziente, stabilire la prognosi ed indicare la terapia. Oggi l'esame istologico è diventato una delle indagini di laboratorio più importanti. Esso viene eseguito sia sui pezzi asportati durante le operazioni chirurgiche, sia su frammenti di tessuto selettivamente prelevati (biopsie). L'anatomo-patologo è spesso in grado di riconoscere la malattia del paziente sulla scorta di tale materiale. Oltre all'esame macroscopico e all'esame istologico, vi sono altre metodiche utili per la diagnosi, quali l'esame citologico, l'esame istologico urgente per congelazione, l'esame ultrastrutturale, le tecniche di biologia molecolare, di immunopatologia e di analisi d'immagine. Anatomia microscopica e sviluppi successivi L'invenzione, nel XVII secolo, del microscopio composto portò allo sviluppo dell'anatomia microscopica, che viene suddivisa in istologia (studio dei tessuti) e citologia (studio delle cellule). Sempre nel XVII secolo l'anatomico italiano Marcello Malpighi compì le prime osservazioni della struttura microscopica di piante e animali. I più importanti anatomici dell'epoca di Malpighi erano, tuttavia, riluttanti ad accettare l'anatomia microscopica, che oggi costituisce, invece, la base dell'anatomia moderna. Oggi le indagini microscopiche si pongono anche l'obiettivo di identificare il rapporto esistente tra la struttura osservata a occhio nudo e quella fornita dal microscopio. Nel corso del XX secolo l'anatomia microscopica conobbe un ulteriore, importante sviluppo grazie all'introduzione di microscopi, dotati di una risoluzione e di un ingrandimento molto superiori agli strumenti convenzionali e, pertanto, in grado di rivelare dettagli prima poco chiari o invisibili. Rispetto al microscopio ottico convenzionale, il microscopio a luce ultravioletta permette, ad esempio, di ottenere un contrasto maggiore, in quanto le lunghezze d'onda di questi raggi sono minori di quelle della luce visibile (il potere di risoluzione di un microscopio è inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda della luce impiegata). Questo tipo di microscopio viene anche utilizzato per sottolineare particolari dettagli, grazie all'assorbimento selettivo, da parte dei tessuti, di determinate lunghezze d'onda presenti nell'ultravioletto. L'invenzione del microscopio elettronico, che rispetto al microscopio ottico raggiunge un potere di risoluzione e livelli d'ingrandimento enormemente superiori, ha consentito di esplorare strutture subcellulari prima intoccabili dall'indagine anatomica. Altri microscopi moderni, come il microscopio a contrasto di fase e il microscopio interferenziale, hanno permesso di osservare materiali viventi privi di colorazione artificiale, i quali sarebbero risultati invisibili al microscopio convenzionale. 3

4 L odierna disponibilità di numerosi strumenti mutuati dalle biotecnologie, quali la Microscopia Elettronica,l Immunoistochimica, la citometria a flusso, la FISH, l ibridizatione in situ, la micro dissezione laser, il Southern/Nortern blot, la Micro-array analysis, la PCR/RT PCR ed il Western blot, che applicati secondo il metodo morgagnano, anno ampliato notevolmente il raggio d azione dell anatomo patologo. Ancora oggi l Anatomia patologica contribuisce in modo rilevante : -all avanzamento della scienza medica -alla educazione medica: Sir Samuel Wilks al Guys Hospital di Londra affermò che la principale risorsa per gli studenti di medicina era lo studio delle autopsie. -al Controllo di Qualità. Prof. G. Federici La proteomica, una nuova scienza al servizio della clinica Il termine Proteomica, riferito alle proteine prodotte da un genoma, è stato coniato per la prima volta nel 1995, e la scienza del proteoma è divenuta in una decade una entità complessa e dinamica. A differenza della staticità delle informazioni ottenibili dall analisi genomica, comunque necessarie e da approfondire ulteriormente, il proteoma è controllato da uno sbalorditivo numero di fattori: complessità in termini di sintesi delle proteine, processi di degradazione o di modificazione che possono agire sulla localizzazione della proteina, interazioni proteina-proteina, legame a molecole di basso peso molecolare o a farmaci, ecc. In questo sviluppo della system biology è stato dato originariamente un notevole impulso all analisi dell espressione dell RNA messaggero ( mrna ) usando tecnologie di microarray per studiare i cambiamenti dell espressione genica. Sebbene la sensibilità e la grande copertura di geni ottenibile con alcune tecniche di biochips (Affimetrix) è chiaramente un vantaggio, è però risultato evidente, da vari studi, che il cambiamento di espressione di mrna è solo una delle vie attraverso le quali il proteoma può essere alterato. E stato dimostrato che sia i livelli assoluti di trascriptoma che quelli di proteoma in caso di perturbazione del sistema con una stimolo non sono necessariamente congruenti. Infatti il proteoma, a differenza della stabilità del genoma di una cellula, possiede una intrinseca complessità e si trova in un costante stato di flusso dipendente dall omeostasi cellulare. Sulla base di quanto sopra sommariamente espresso risulta evidente che l applicazione delle tecnologie proteomiche è vitale per lo studio dei sistemi complessi, identificando le interazioni proteina-proteina o le modificazioni post-traduzionali che avvengono dopo l espressione di alcune proteine. Un ulteriore importante aspetto di questa area chiave per system Bioloy è legato alla identificazione di biomarcatori. In questo contesto campioni biologici sono screnati per evidenziare il contenuto proteico che correli con la malattia o con la prognosi. L enorme sviluppo della proteomica fin qui raggiunto è stato possibile grazie alla concomitante crescita in sensibilità e range dinamico delle tecniche di spettrometria di massa. Esistono oggi varie tipologie di spettrometri di massa utilizzabili nello studio del sistema complesso proteoma ( ESI-MS-MS, MALDI-TOF, sistemi Ibridi MS-TOF, FTICR-MS) che, accoppiate con metodi di separazione on-line, consentono di identificare e quantificare le singole proteine da miscele complesse quali siero, plasma, estratti cellulari. Saranno analizzate applicazioni di massa imaging per individuare il proteoma presente su preparati istologici sia freschi che fissati in formalina. E appena il caso di ricordare come negli archivi delle Anatomie Patologiche esistano milioni di preparati con diagnosi accertate. Un ulteriore aspetto reso possibile dallo sviluppo delle tecnologie di spettrometria di massa e da quelle di NMR ad alta risoluzione è stato lo sviluppo della nuova scienza di Metabonomica che 4

5 può favorire lo screening rapido di vari fattori sia per lo studio di efficacia di farmaci che per l analisi di effetti tossici. La combinazione delle due metodiche, complementare a quelle sopra descritte, può fornire un profilo chimico o biochimico per uno specifico liquido corporeo. Pof. S. Bernardini Microarray: stato dell arte La tecnica del microarray si è sviluppata negli ultimi anni come un metodo efficace per l'analisi simultanea di migliaia di geni e delle loro interazioni reciproche nell ambito degli studi di genomica funzionale. I principi di questa tecnica originano dai metodi di ibridazione comunemente utilizzati in biologia molecolare, dall'utilizzo di molecole fluorescenti, derivanti dalle applicazioni della microscopia a fluorescenza e dai miglioramenti tecnologici per la preparazione di collezioni di acidi nucleici su un supporto solido. Un microarray consiste di una collezione di sequenze di acidi nucleici immobilizzate su un supporto solido (spots). Gli acidi nucleici possono essere essenzialmente cdna o oligonucleotidi ed esistono numerosi metodi per la loro deposizione sul supporto. In generale, in base alla dimensione degli spots si possono distinguere due diversi tipi di arrays: macroarrays e microarrays. I macroarray sono caratterizzati da spots delle dimensioni superiori ai 300 micron in genere depositati su membrane da filtro. I microarray invece sono caratterizzati da spots con un diametro inferiore ai 200 micron, depositati su un supporto di vetro; i microarrays sono perciò caratterizzati dal contenere decine di migliaia di spots in un'area totale di pochi centimetri quadrati. Esistono arrays per lo studio dell espressione genica ed arrays per studi di genotipizzazione. Un tipico esperimento di microarray per lo studio differenziale dell espressione genica può essere sintetizzato nei seguenti passaggi : -costruzione di un supporto solido, in genere un vetrino da microscopio, su cui vengono depositate le sonde (a cdna o oligonucleotidi). -creazione del "target" da analizzare, cioè di un pool di cdna marcato con fluoroforo. Questo passaggio prevede innanzitutto l'estrazione e la preparazione del mrna dalle due situazioni sperimentali che si vogliono comparare (ad esempio cellule di un tessuto patologico verso cellule di un tessuto normale, oppure cellule derivate da un tessuto trattato con farmaci verso un controllo non trattato e così via). Le due popolazioni di mrna vengono retrotrascritte separatamente con l'incorporazione di nucleotidi marcati con fluorofori diversi, producendo due popolazioni di cdna differentemente marcate; -ibridazione del vetrino. Le due popolazioni di cdna marcati vengono combinati e poi ibridati simultaneamente sul vetrino dove formano dei duplex con le sonde complementari. La correttezza dell ibridazione è influenzata da alcuni parametri quali la stringenza di ibridazione (ad esempio la temperatura), la concentrazione del campione, la lunghezza dei targets, gli effetti sterici delle molecole fluorescenti, la chimica di superficie ed i tempi di ibridazione stessa; -l'analisi del segnale fluorescente di ibridazione può essere effettuata con l'uso di lettori che generalmente si basano su laser con fluorescenza confocale o sistemi digitali (scanner). I dati di un singolo esperimento di ibridazione vengono indicati come rapporto normalizzato tra l'intensità delle due fluorescenze (es: Cy3/Cy5): significative deviazioni dall unità indicano un aumento (>1) o una riduzione (<1) dei livelli di espressione del gene in esame rispetto al sistema di riferimento. Quindi se un particolare mrna predomina in uno dei due campioni, il colore del fluoroforo corrispondente prevarrà sull'altro, indicando che quel dato gene è più espresso in un sistema piuttosto che nell'altro con cui viene comparato. Attraverso complessi sistemi bioinformatici sarà poi possibile analizzare l'enorme quantità di dati ottenuti cercando anche di creare un modello interpretativo. 5

6 L'analisi genomica mediante microarray è una tecnologia molto promettente e utile nella genetica e medicina molecolare, che permette l'analisi di mutazioni e di polimorfismi più rapida rispetto alle tecniche tradizionali tra cui SSCP, DGGE e sequenziamento diretto. Grazie alla tecnologia del microarray, si possono infatti comparare sequenze di DNA genomico con sequenze di riferimento e identificare così polimorfismi nell'intero genoma attraverso un singolo esperimento di ibridazione. 6