Nuovi approcci all identificazione e caratterizzazione di geni regolati

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1 Nuovi approcci all identificazione e caratterizzazione di geni regolati Nuovi approcci all identificazione e caratterizzazione di geni regolati dallo Scatter Factor HGF e dal suo recettore Met HGF Met Trasformazione Crescita invasiva Sopravvivenza Proliferazione Scatter Sos Ras PI3K Bag1 Grb2 p85 P P Y Y Y Y P P STAT Gab1 Grb2 Ezrina P P P p85 PLC-g PI3K METASTASI MORFOGENESI 1

2 La risposta trascrizionale all HGF mrna presenti allo stato basale mrna presenti dopo stimolazione con HGF mrna basali Stimolazione con HGF mrna basali mrna repressi mrna indotti mrna basali stimolazione mrna basali mrna repressi mrna indotti 1. DIFFERENTIAL DISPLAY 2. SUBTRACTED LIBRARIES 3. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA SU MICROARRAY 4. TECNICA DEL GENE TRAP 2

3 1.DIFFERENTIAL DISPLAY 2. SUBTRACTED LIBRARIES 3

4 4

5 3. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA su MICROARRAY o MACROARRAY Campione di controllo SOPPRESSI INDOTTI Estrazione dell RNA, sintesi del cdna e marcatura. INVARIATI Campione stimolato MICROARRAY cdna Image from Gene-Chips (Microarray) 5

6 stimulated x induced 100 2x suppressed Unstimulated MACROARRAY 6

7 7

8 MACROARRAY SU NYLON MICROARRAY SU SLIDES Dimensioni campioni 5 µg RNA totale 0.5 µg mrna µg RNA totale 10 µg mrna Sistemi di rivelazione 33 P, 32 P Fluorescenza (Cy3, Cy5) Analisi di immagine Ibridizzazione Volume ibridizzazione phosphorimager Su due filtri diversi 5-40 ml (come un Northern) Laser confocale Sullo stesso vetrino 2-10 µl Geni analizzati Costi Analisi dati contenuti complessa Fino a Elevati (attrezzatura) Molto complessa 8

9 Major HGF-regulated genes and total cdnas corresponding to extracellular matrix proteins contained on the microarray Genes regulated by HGF >3-fold are listed in order of fold induction and italicized. In addition, all of the cdnas corresponding to extracellular matrix proteins, extracted from a total of 8735 spotted cdnas, are listed in alphabetical order. Average induction and SD were obtained from a triplicate comparison between unstimulated and HGFstimulated (6h) cells. To enrich for target genes associated with HGF-induced scattering, two experiments were performed in 0.1% serum and one in 2% serum. MLP-29 cells respond to HGF and EGF by increasing OPN mrna and protein Western blot analysis of OPN protein expression by MLP-29 cells after different times of HGF or EGF stimulation, as indicated. Total cell lysate (20 mg) was loaded per lane, followed by fractionation in 8% SDS-PAGE and immunoblotting. 9

10 4. TECNICA DEL GENE TRAP GFNR (Green Fluorescent Nitro-Reductase) EGFP GFNR NTR quando una cellula esprime la proteina di fusione GFNR diventa al tempo stesso fluorescente e sensibile al Metronidazolo (MN) Vettore di espressione per GFNR 10

11 Validazione della proteina di fusione: fluorescenza e sensibilità al MN Fluorescence and drug sensitivity of 293T cells transiently transfected with pegfp, pgfnr, and pntr. Relative pgfnr efficiency was estimated either by flow cytometric analysis (left) or by cell counting after 48 h of MN treatment (right). A fluorescence efficiency of 100% corresponds to the mean fluorescence intensity of the green fluorescent subpopulation in the pegfptransfected cells. A killing efficiency of 100% corresponds to the difference in cell number between mock-transfected and pntr-transfected MN-treated cells. Error bars represent standard deviation of triplicates. Validazione della proteina di fusione: correlazione fra fluorescenza e sensibilità al MN Correlation between fluorescence and MN sensitivity in stable transfectants. MLP-29 cells were transfected with pgfnr, selected with G418, and FACS-analyzed for green fluorescence before and after 48 h of MN treatment. For the analysis, three classes of fluorescence were identified and defined as low, medium, and high. In the untreated population, the number of cells in each class was assigned the 100% value. After treatment, the abundance of each fluorescent subpopulation was compared with the respective control sample, and percentage of survival was estimated. Error bars are not present because data were obtained by a FACS-based population analysis. 11

12 Vettore di espressione per GFNR e trappola genica Meccanismo di intrappolamento genico Promotore Gene endogeno Esone1 Esoni 2,3... Introne1 mrna Coda di polia TRAPPOLA GENICA Gene intrappolato Promotore Esone1 SA EGFP GFNR NTR Cassetta Neo PGK prom neo pa mrna ibrido Esone1SA GFNR EGFP NTR Cassetta Neo PGK neo prom pa Coda di polia 12

13 Un reporter per i geni regolati: GFNR (Green Fluorescent Nitro-Reductase) GFNR EGFP NTR quando una cellula esprime la proteina di fusione GFNR diventa al tempo stesso fluorescente e sensibile al Metronidazolo (MN) le cellule in cui la trappola genica è integrata a valle di un promotore attivo possono essere identificate e selezionate positivamente al FACS le integrazioni a valle di promotori costitutivi possono essere controselezionate mediante trattamento con MN le integrazioni a valle di promotori regolati dall HGF possono essere selezionate stimolando le cellule con HGF prima della selezione positiva (geni indotti) o negativa (geni soppressi) Ottimizzazione delle procedure di selezione positiva infezione selezione contemporanea con G418 e con MN sopravvivono tutti i cloni che hanno integrato il DNA nel loro genoma (G418 è un analogo della neomicina) muoiono i cloni che hanno integrato la gene trap in un gene trascritto attivamente (geni housekeeping) rimozione del MN stimolazione con HGF e isolamento ( sorting ) delle cellule fluorescenti le cellule fluorescenti sono quelle che hanno integrato la gene trap in un gene indotto dall HGF TRAPPOLA GENICA screening dei cloni sopravvissuti per SA GFNR Cassetta Neo identificare quelli indotti dall HGF EGFP NTR PGK prom neo pa 13

14 Ottimizzazione delle procedure di selezione negativa infezione selezione con G418 isolamento ( sorting ) delle cellule fluorescenti stimolazione con HGF e controselezione con MN screening dei cloni sopravvissuti per identificare quelli soppressi dall HGF sopravvivono tutti i cloni che hanno integrato il DNA nel loro genoma (G418 è un analogo della neomicina) le cellule fluorescenti sono quelle che hanno integrato la gene trap in un gene attivamente trascritto (geni housekeeping) muoiono i cloni che hanno integrato la gene trap in un gene housekeeping o in un gene indotto dall HGF sopravvivono i cloni che hanno integrato la gene trap in un gene soppresso dall HGF TRAPPOLA GENICA SA GFNR Cassetta Neo EGFP NTR PGK prom neo pa Analisi al citofluorimetro di popolazioni di cellule trappate HGF induced traps First round HGF induced traps Second round HGF suppressed traps 14

15 ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEI CLONI Clone E3.2 Clone HF-57 Controllo HGF Responsività all HGF dei cloni intrappolati Abbondanza relativa (%) > 3 Abbondanza relativa (%) >3 Livelli di induzione Livelli di soppressione 15

16 RACE = RAPID AMPLIFICATION OF cdna ENDS TRAPPOLA GENICA Gene intrappolato Promotore Esone1 SA EGFP GFNR NTR Cassetta Neo PGK prom neo pa mrna ibrido retrotrascrizione con primer Esone1 SA su GFNR EGFP GFNR NTR Cassetta Neo PGK neo prom pa Coda di polia add oligo poly G cdna primer poly C PCR prodotto di PCR Identificazione dei geni intrappolati Sequenza del prodotto di 5 -RACE del clone 3E1.8 CCCNCNTCNC GGCNTTGTTA CNACNGCTTG CCNAAAGTAT CCAGTGAGAG AGGCAGATGC CCTGGGTGGT AGAGCAGGCT GCTGGTCTGG TCCTCTCTTC AGGAGATTTG CAACCCTGGA CAGTAGCGAT ACCGTCGATC CCCACTGGAA AGACGCGAAG AGTTTGTCCT CAACCGCGAG ATGGNGGCGA CGGTAGCGCT primer della RACE gene Tmp SA EGFP Su 10 cloni sequenziati: 2 corrispondono a geni noti: Tmp e Sprr2h 3 corrispondono a EST: AA274109, AI e C corrispondono a sequenze ripetitive 1 non corrisponde ad alcuna sequenza nota 16

17 Specificità delle traps HGF FBS HGF+FBS Fold Induction HF-39 E3.2 (Novel) EST Tmp E4H-20-6 Sprr2H H5-16 H5-17 Unknown Validazione della trappola Abbondanza relativa (%) Sprr2h GAPDH Tempo (ore) Abbondanza relativa (%) EST AI GAPDH Tempo (ore) Northern blot (RNA di cellule MLP-29 stimolate con HGF a tempi diversi) 17

18 Conclusioni e Prospettive è stato sviluppato un nuovo approccio di intrappolamento genico che consente di identificare in modo veloce ed efficiente i geni la cui trascrizione è regolata da stimoli esogeni (in questo caso l HGF) l ottimizzazione delle procedure permette lo screening funzionale dell intero genoma; sono stati così isolati numerosi cloni responsivi all HGF i cloni responsivi costituiscono un insieme di cellule reporter nelle quali si possono valutare, mediante analisi citofluorimetrica, le risposte trascrizionali dei geni intrappolati, usando anche stimoli diversi dall HGF per una caratterizzazione funzionale più dettagliata 18