Identificazione microbica con metodi colturali, non colturali e rapidi

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Gaetano Raffaele Mattioli
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1 Identificazione microbica con metodi colturali, non colturali e rapidi

2 Metodi microbiologici rapidi valutazioni qualitative reazioni antigene-anticorpo identificazione molecolare Su singolo isolato o su campione reazioni enzimatiche/assimilazioni Su singolo isolato valutazioni quantitative metodi immunoenzimatici Su singolo isolato o su campione metodi di PCR quantitativa Su singolo isolato o su campione

3 utilizzazione di composti del carbonio glucosio, lattosio, saccarosio, mannitolo, inositolo, ramnosio, melibiosio amido citrato ossidazione acidi fermentazione acidi gas (CO 2, O 2 ) prodotti neutri Idrolisi a destrine, maltosio, glucosio basi test O/F mezzo con indicatore di ph Mezzo con indicatore di ph liquido solido con metodica dei dischetti test O/F Campanella di Durham in mezzo liquido fratture in mezzo solido Rilevamento acetilmetilcarbinolo test MR/ VP Reazione con iodio su agar amido Indicatore di ph in agar citrato contenente ammonio fosfato

utilizzazione di composti dell azoto proteine aminoacidi Aminoacidi solforati, solfiti, tiosolfati triptofano caseina gelatina deaminazione decarbossilazione Idrolisi (peptonizzazione) idrolisi

4 utilizzazione di composti dell azoto proteine aminoacidi Aminoacidi solforati, solfiti, tiosolfati triptofano caseina gelatina deaminazione decarbossilazione Idrolisi (peptonizzazione) idrolisi Chetoacido + NH 3 Ammina + CO 2 H 2 S indolo Chiarificazione in agar latte Liquefazione mezzo nutriente con gelatina Reazione di ac.fenilpiruvico con FeCl 3 in mezzo con fenilalanina Indicatore di ph per alcalinizzazione in mezzo con peptone o arginina Indicatore di ph in mezzo con lisina, ornitina o arginina Reazione con indicatore Pb acetato o con sali di Fe Reazione con Kovacs

6 Enterobacter aerogenes Differenziazione coli-enterobacter classica con test IMViC: IndoloRosometileVogesProskauerCitrato Escherichiacoli Enteroacteraerogenes

7 FONDO: Urea Agar Strato idrofobo INTERMEDIO: Modified Lysine Iron Agar ALTO: Lysine Iron Agar. VALUTAZIONE DI: ureasi Lisina decarbossilasi Lisina deaminasi Proiduzione di solfuro di idrogeno

wehienstephanensis Patogeno umano Produce endotossina

8 Gruppo cereus o B. cereus sensu lato B. cereus B. thuringiensis B. cereus var. mycoides B. anthracis B. wehienstephanensis Patogeno umano Produce endotossina cristallina, entomopatoge no Crescita rizoidale Patogeno umano/ani male Patogeno umano + B. cytotoxicus

9 Feature B. cereus B. thuringiensis B. cereus var. mycoides B. anthracis B. megaterium Gram reaction + a Catalase Motility +/- b +/- - c - +/- Reduction of nitrate + +/ d Tyrosine decomposed + + +/- - d +/- Lysozyme-resistant Egg yolk reduction Anaerobic utilization of glucose VP reaction Acid produced from mannitol Hemolysis (sheep RBC) Known pathogenicity c d - Produces enterotoxins a +, % of strains are positive b +/-, 50-50% of strains are positive c -, % of strains are negative d -, most strains are negative Endotoxin crystals pathogenic to insects Rhizoidal growth Pathogenic to animals and humans

10 Approved detection methods for B. anthracis Test Procedure Laboratory Level A B C D Gram stain (micromorphology) x x x x Capsule (microscopic observation) x x x x Routine culture: 1. Colonial morphology x x x x 2. Hemolysis x x x x 3. Motility x x x x 4. Sporulation (microscopic observation) x x x x Confirmatory tests: 1. Lysis by gamma-phage x x x 2. Direct fluorescence assay (DFA)(polysaccharide cell wall and capsule) x x x

14 King s agar medium

15 Metodi biochimici rapidi: strisce API piastre BIOLOG

16 Esempio: strisce API 20 NE (batteri gram negativi non enterici)

26 PROCEDURA PER ANALISI BIOLOG DI BATTERI GRAM- GRAM+ Strisciati e incubati 4-24h a 30 C Dalla piastra preparare sospensione cellulare in soluzione fisiologica (0.85% NaCl) fino a raggiungere torbidità pari a circa 52% del bianco Inoculare immediatamente le piastre GN2 con 150µl di sospensione per pozzetto Dalla piastra preparare sospensione cellulare in sol.fisiologica + sodio tioglicollato fino a torbidità pari a circa 28% del bianco Inoculare immediatamente le piastre GP2 con 150µl di sospensione per pozzetto Coprire le piastre ed incubare 16-24h: non enterici a 30 C enterici a C Coprire le piastre ed incubare 16-24h: bastoncelli sporigeni a 30 C cocchi o bast. non sporigeni a C

27 GN2

28 GP2

29 iodo-nitro-phenyl-tetrazolium Formazano (violetto di tetrazolio)

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