Caratterizzazione dei geni coinvolti nelle nuove traslocazioni riguardanti la banda 14q32

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1 2 Workshop SIES di Ematologia traslazionale Verona, Maggio 2009 Caratterizzazione dei geni coinvolti nelle nuove traslocazioni riguardanti la banda 14q32 Identificazione di una correlazione tra l'espressione di specifiche classi di geni e la risposta alla terapia con fludarabina in soggetti con LLC

2 Caratterizzazione dei geni coinvolti nelle nuove traslocazioni riguardanti la banda 14q32

3 29 casi con IgH R Dual color dual fusion FISH Identificazione del gene partner in 8 casi t(6;14)(p12;q32)/ccnd3 1 caso 1 caso 5 casi 1 caso t(2;14)(p13;q32)/bcl11a t (14;18)(q32;q21)/BCL2 t (7;14)(q21;q32)/CDK6 21 casi con partner ignoto Inverse PCR

4 Inverse PCR (IPCR) Metodo per l amplificazione in vitro di sequenze di DNA incognito fiancheggiate da sequenze note Regione nota Digestione del DNA genomico con un singolo enzima di restrizione che non ha siti di taglio nella regione nota Regione nota Ligation dei frammenti in soluzione diluita per favorire la circolarizzazione di singoli monomeri nota Regione PCR con oligonucleotidi omologhi alle estremità della regione nota, ma in direzione opposta rispetto al solito

5 Risultati preliminari Marker Neg Germline Pat.#1 Pat.#2 Pat.#3 Pat.4 Pat.#5 Pat.#6 PCR J6I-JXI Patient VH DH JH #1 V1-3 D2-8 J3 #2 V1-2 D3-3 J6 #3 V4-39 D6-13 J5 #4 V3-21 #5 V1-69 D2-2 J6 #6 V3-21 D3-10 J6 Tutte le bande sequenziate mostravano il solo riarrangiamento funzionale del gene IGH

6 IPCR su Linfoma Follicolare con t(14;18)(q32;q21) PstI BCL2 IGH Clonaggio mediante IPCR e successiva sequenza del punto di fusione tra IGH e BCL2 localizzazione del breakpoint a monte di J6

7 Restrizione del breakpoint in FISH RP11-731F5 RP11-965B13 RP11-151B17 RP11-298J6 RP11-11J18 RP11-151B17 FISH con un contig di 6 cloni BAC parzialmente sovrapposti e in grado di mappare la regione di circa 500 kb candidata alla traslocazione

8 Risultati preliminari RP11-731F5 RP11-298J6 cosα1 Breakpoint nella regione costante, tra Cα1 e Cγ3 What s s next? IPCR con primers nella regione costante del gene IGH

9 Risultati preliminari RP11-298J6 RP11-151B17 RP11-965B13 RP11-11J18 Breakpoint nella regione variabile, tra V6-1 e V3-20

10 What s s next? IPCR con numerose coppie di oligonucleotidi posti nella regione variabile del gene IGH 5 casi con traslocazione IGH/BCL2 IPCR con primers su BCL2

11 Identificazione di una correlazione tra l'espressione di specifiche classi di geni e la risposta alla terapia con fludarabina in soggetti con LLC

12 Disegno sperimentale Studio condotto su pazienti trattati per 5 giorni con fludarabina (primo ciclo di somministrazione di terapia contenente fludarabina) 7 pazienti con Risposta Completa alla fludarabina (CR, secondo i criteri NCI), esclusi i casi con 17p-, prima e dopo trattamento 8 pazienti Non Resposivi alla fludarabina (CS), esclusi i casi con 17p-, prima e dopo trattamento Separazione di cellule mononucleate da sangue periferico mediante gradiente di densità Ficoll Hypaque Isolamento ed analisi del RNA Ibridazione su Microarray (Gene/miRNA Expression Profiling)

13 Gene Expression Profiling (pre) 246 geni differenzialmente espressi tra pazienti resistenti (CR) e pazienti sensibili (CS) alla fludarabina CR CS T Test unpaired unequal variance (test di Welch) p<0.02 Fold change >= 2.0 Normalizzazione quantilica

14 Risultati Microarray (pre) TP53 e CCND1 Up-regolate nei CS rispetto a CR prima del trattamento con fludarabina CS pre CR pre ITPK1(Reversible Inositol Phosphate Kinase/Phosphatase) Gene predittivo della risposta alla fludarabina prima del trattamento (up-regolato in CS rispetto a CR)

15 Gene Expression Profiling (post) 342 geni differenzialmente espressi tra pazienti CR e CS dopo trattamento con fludarabina CR CS T Test unpaired unequal variance (test di Welch) p<0.02 Fold change >= 2.0 Normalizzazione quantilica

16 Normalizzazione dei livelli di ciascun campione post fludarabina sui livelli dello stesso paziente pre trattamento eliminazione effetto-paziente Pathway modulati in modo significativo nei CR e nei CS

17 Risultati Microarray (post) p53-pathway : Up-regolato nei CS rispetto ai CR CS post CR post

18 BH3-only pathway Puma (BBC3): Up-regolato nei CS rispetto ai CR post fludarabina CS pre CR pre CS post CR post

19 What s s next? Validazione mediante qrt-pcr dei geni TP53, p21, PUMA, GADD45A, MDM2, ITPK1, sugli stessi campioni e su altri casi Analisi di altri pathway che vengono modulati dal trattamento con fludarabina in maniera diversa nei pazienti CR rispetto ai CS Completamento e analisi dei dati riguardanti l espressione dei mirna nei due gruppi di pazienti

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