Il Laboratorio di Microbiologia e il Medico di Famiglia Punti di criticità

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1 Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche e Microbiologiche SOC Area NORD AUSL Reggio Emilia Direttore: Dott.ssa Rossana Colla Il Laboratorio di Microbiologia e il Medico di Famiglia Punti di criticità D.ssa Silvia Storchi Incerti Reggio Emilia 11 febbraio 2015

2 CRITICITA - Appropriatezza fase preanalitica -Tempistica di risposta (lenta) - Induzione terapeutica Appropriatezza prescrittiva Gestione del dato microbiologico ANTIBIOTICORESISTENZE

3 PREMESSA La diagnostica microbiologia consiste nell identificare la causa microbica di una malattia o di una infezione, allo scopo di suggerire un appropriato trattamento terapeutico.

4 Diagnostica microbiologica Appropriatezza della fase pre-analitica PRELIEVO DEL CAMPIONE MODALITA DI RACCOLTA DEL CAMPIONE MODALITA DI TRASPORTO DEL CAMPIONE MODALITA DI CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

5 FASE PREANALITICA La raccolta, il trasporto e la conservazione dei campioni biologici sono la base fondamentale per produrre risultati attendibili nell esecuzione delle indagini microbiologiche. Gli esiti degli esami batteriologici sono fortemente condizionati dalla qualità del campione. L appropriatezza della fase preanalitica implica una conveniente selezione, un approfondita raccolta ed un tempestivo trasporto di tutti i campioni. Una fase preanalitica non rispondente ai requisiti previsti porta ad un sicuro insuccesso nell isolamento dei microrganismi responsabili della patologia del paziente, a causa della possibilità di sviluppo di contaminanti che possono indurre alla somministrazione di terapie antibiotiche inutili.

6 QUALI REGOLE GENERALI DEVE RISPETTARE CHI RACCOGLIE IL CAMPIONE? 1) La raccolta del campione DOVREBBE avvenire PRIMA della terapia antibatterica. 2) La raccolta deve essere effettuata nella sede anatomica dell infezione. 3) Prelevare la quantità sufficiente di materiale. 4) Evitare ogni contaminazione esogena ed endogena.

7 QUALI REGOLE GENERALI DEVE RISPETTARE CHI RACCOGLIE IL CAMPIONE? 5) Utilizzare appropriati sistemi di raccolta. 6) Contrassegnare il contenitore del campione con il nome del paziente. 7) Identificare correttamente la natura e l origine del campione affinchè possano essere selezionati i più idonei terreni di coltura e le tecniche diagnostiche appropriate. 8) Consegnare prontamente i campioni in laboratorio.

8 INVIO DEL CAMPIONE BIOLOGICO AL LABORATORIO Il trasporto deve avvenire nel più breve tempo possibile: 1) per assicurare la sopravvivenza e la vitalità dei microrganismi patogeni ed impedire o ridurre una crescita veloce dei batteri più resistenti; 2) per abbreviare la durata del contatto dei campioni con alcuni anestetici locali usati -nelle procedure di raccoltache possono avere attività antibatterica. N.B. Idealmente, quasi tutti i campioni in generale dovrebbero essere trasportati tra le 2-4 ore per consentire al personale di laboratorio un tempestivo inserimento nel sistema analitico.

9 COLONIZZAZIONE O INFEZIONE O MALATTIA? COLONIZZAZIONE: riproduzione di germi in una o più zone dell'organismo. INFEZIONE: agenti patogeni o opportunisti che superano le barriere naturali di difesa invadendo i tessuti dell ospite; ne consegue una risposta del sistema immunitario senza portare danno all ospite. MALATTIA: sono presenti effetti dannosi dovuti all azione diretta del patogeno ovvero dei suoi prodotti (tossine, ecc.), oppure la reazione immune di risposta è stata a sua volta esagerata o dannosa. Ma tali definizioni devono essere necessariamente valutate clinicamente

10 Microflora normale dei distretti corporei

11 INDAGINI MICROBIOLOGICHE MAGGIORMENTE RICHIESTE ANNO 2014 Descrizione Esterni URINOCOLTURA (Coltura per batteri su urina da mitto intermedio) TAMPONI DI SUPERFICIE (Coltura per Aerobi e miceti(lieviti,muffe)-tamponi-mat.vari) 1212 Coprocoltura Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter spp 989 Ricerca parassiti intestinali su feci. 982 TAMPONE FARINGEO (Colturale Streptococco pyogenes Tampone orofaringeo). 924 TAMPONE VAGINALE, URETRALE (Coltura batteri,lieviti,trichomonas-camp.urogenitali). 892 TAMPONE VAGINO-RETTALE (Coltura per Streptococcus agalactiae (gruppo B). 783 FECI RICERCA MICETI (Coltura miceti, lieviti, da mat.vari semina agar). 228 Virus Rotavirus antigeni ricerca diretta su Feci. 206 Ricerca diretta Ag etossine A/B Clostridium Difficile-Feci. 170 Coltura per Aerobi e miceti (lieviti,muffe)-liquidi-mat.vari 168 Dermatofiti e Lieviti Coltura su unghie. 158 Scotch test per ricerca Ossiuri (Enterobius vermicularis). 155 Virus Adenovirus antigeni ricerca diretta su Feci. 152 Colturale per Salmonella (igene pubblica). 77 ESCREATO (Coltura batteri,lieviti - camp.respiratori). 66 Dermatofiti e Lieviti Coltura + Microscopico su squame. 24

12 URINOCOLTURA Quesito diagnostico: infezioni vie urinarie EZIOLOGIA PREVALENTE: - Batteri aerobi ALTRI AGENTI: miceti FLORA COMMENSALE assente TIMING DI PRELIEVO: quando possibile, prima della terapia antibiotica Fase preanalitica: Urina raccolta da mitto intermedio; Urina raccolta da catetere

13 URINOCOLTURA RACCOLTA DEL CAMPIONE Utilizzare preferibilmente la prima urina del mattino (se non possibile almeno tre ore dopo l ultima minzione) Fare una corretta igiene prima della raccolta: lavarsi prima le mani e poi accuratamente i genitali esterni aprire il contenitore sterile immediatamente prima dell uso, senza toccare la parte interna del contenitore e del coperchio urinare scartando il primo getto e poi raccogliendo direttamente nel contenitore il mitto intermedio Riempire per ¾ il contenitore facendo sempre attenzione a non toccare l interno o i bordi con le mani o i genitali Richiudere bene avvitando il tappo recapitare in laboratorio campioni freschi: tra la raccolta e il trattamento dei campioni non dovrebbero passare più di 2-4 ore

14 Raccolta urina da catetere vescicale Un esempio: Clampare il tubo di drenaggio con il morsetto in dotazione a valle del punto di prelievo. Lavarsi le mani ed indossare i guanti. Prelevare l urina nel punto di prelievo previa disinfezione della membrana con garza sterile imbevuta di antisettico utilizzando ago e siringa sterile (utilizzare ago di piccolo calibro). Rimuovere il morsetto, mettere l urina nel contenitore indicato per lo specifico esame da effettuare (contenitore tappo giallo con sonda di prelievo incorporata per urocoltura). Rimuovere i guanti e lavarsi le mani. Recapitare in laboratorio campioni freschi: tra la raccolta e il trattamento dei campioni non dovrebbero passare più di 2-4 ore.

15 ESITO NEGATIVO: UROCOLTURA INTERPRETAZIONE - Screening (risposta rapida), Esame batterioscopico: CARICA BATTERICA NON SIGNIFICATIVA; - Esame colturale: ASSENZA DI CRESCITA o Carica batterica < UFC/ml sviluppo di flora microbica mista Carica batterica maggiore di UFC/ml Campione inquinato dove non è possibile isolare almeno 2 specie batteriche.

16 UROCOLTURA INTERPRETAZIONE ESITO POSITIVO: - Carica batterica: > UFC/ml (carica batterica significativa di infezione urinaria per urina da mitto intermedio) - Carica batterica: > UFC/ml (carica batterica significativa di infezione urinaria per urina da catetere) - Specie batterica isolata (max 2) ANTIBIOGRAMMA: eseguito di routine Eccezione: miceti

17 Colonizzazione urinaria Preferibile al termine di «batteriuria asintomatica» Situazione caratterizzata da presenza di patogeni urinari (rilevata in due es. microbiologici successivi), con carica >=10 5 CFU/ml, ma assenza di segni clinici.

18 TEMPI DI RISPOSTA Dopo l accettazione del campione: in giornata se l urinocoltura risulta NEGATIVA Metodiche rapide 48 ore se l urinocoltura risulta POSITIVA

19 CONTROLLO EFFICACIA TERAPIA ANTIBIOTICA Al termine del trattamento non ripetere l urinocoltura se il paziente non ha più sintomi. L urinocoltura può essere eseguita almeno 7 giorni dopo la fine del trattamento antibiotico. Torniamo sull urinocoltura positiva

20 L ANTIBIOGRAMMA

21 DATI DESUMIBILI DALL ANTIBIOGRAMMA Microrganismo isolato. Carica batterica: per urina raccolta da mitto intermedio carica batterica significativa di infezione urinaria >= UFC/ml (UFC= Unità Formanti Colonie). Per urina raccolta da pazienti cateterizzati carica batterica significativa di infezione urinaria >= 1000 UFC/ml (UFC= Unità Formanti Colonie).

22 DATI DESUMIBILI DALL ANTIBIOGRAMMA Elenco antibiotici saggiati opportunamente scelti in base al microrganismo isolato. MIC (concentrazione minima inibente): metodo standard per misurare l attività antibatterica di un antibiotico in vitro intesa come la più bassa concentrazione di antibiotico capace di inibire la crescita di una popolazione standard di batteri.

23 Ricordando che

24 MIC La più bassa concentrazione di antibiotico capace di inibire la crescita di una popolazione standard di batteri.

25 DATI DESUMIBILI DALL ANTIBIOGRAMMA Categoria clinico-terapeutica (RSI) del microrganismo isolato cioè Resistente (R*), Sensibile (S**), Intermedio (I***). *Resistente: la crescita batterica non è inibita dalle concentrazioni di antibiotico comunemente raccomandate. **Sensibile: l antibiotico risulta efficace ai dosaggi comunemente raccomandati. I microrganismi sono inibiti dalle concentrazioni di antibiotico raggiungibili a seguito della somministrazione del dosaggio previsto per il sito di infezione. ***Intermedio: la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato; la percentuale di risposta è inferiore a quella ottenibile da ceppi sensibili. NB : La sensibilità in vitro non predice il successo terapeutico. La resistenza in vitro dovrebbe predire un fallimento terapeutico

26 Ricordando che

27 SCELTA DELLA MOLECOLA DI ANTIBIOTICO DA PRESCRIVERE Dovrebbe prediligere l antibiotico con MIC più bassa in rapporto al relativo breakpoint (vedi tabelle in Allegato1) e con minore capacità di indurre resistenze. Breakpoint: valori di MIC utilizzati come soglia, per esprimere la condizione di Sensibile, Intermedio e Resistente dei microrganismi nei confronti degli antibiotici. Tali valori sono definiti da comitati internazionali di esperti (CLSI, EUCAST, FDA, ecc.) e tengono conto di parametri batteriologici, farmacocinetici e clinici.

28 SCELTA DELLA MOLECOLA DI ANTIBIOTICO DA PRESCRIVERE Tenere conto delle resistenze naturali (alcuni esempi): Enterobacteriaceae: Penicillina G, glicopeptidi, acido fusidico, linezolid, macrolidi, lincosamidi, streptograminie, mupirocina. Providencia spp.: Ampicillina, amoxicillina, amoxicillina/ac.clav., cefalosporine I gen., aminoglicosidi, colistina, nitrofurantoina.

29 SCELTA DELLA MOLECOLA DI ANTIBIOTICO DA PRESCRIVERE Tenere conto delle resistenze acquisite: sul referto saranno segnalate con le note seguenti: a) CEPPO BATTERICO PRODUTTORE DI BETALATTAMASI AD AMPIO SPETTRO : automaticamente il sistema automatizzato che esegue l antibiogramma correggerà la categoria terapeutica in Resistente (anche se la MIC effettivamente misurata appartiene alla categoria Sensibile ) in corrispondenza degli antibiotici che saranno inattivi a causa di tale fenomeno. b) Staphylococcus aureus METICILLINO-RESISTENTE (MRSA). Secondo le raccomandazioni C.L.S.I. gli Stafilococchi oxacillinoresistenti (MRSA) vanno considerati resistenti a tutte le Cefalosporine,tutte le combinazioni Betalattamine/Inibitori betalattamasi, tutti i Carbapenemi e Penicilline. Viene considerata l equivalenza oxacillina-meticillina.

30 SCELTA DELLA MOLECOLA DI ANTIBIOTICO DA PRESCRIVERE c) STAFILOCOCCCO/ENTEROCOCCO VANCOMICINA RESISTENTI E/O INTERMEDI. d) CEPPO BATTERICO PRODUTTORE DI METALLO-BETA- LATTAMASI (MBL) (es. Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., E. coli, S. maltophilia, Serratia spp.). e) CEPPO BATTERICO PRODUTTORE DI CARBAPENEMASI VEROSIMILMENTE TIPO KPC O MBL. In casi particolari (es. allergie a determinate molecole di antibiotici, patologie concomitanti ecc..), potrebbe essere utile valutare le equivalenze degli antibiotici testati in vitro (tabella 3).

31 TAB. 3 CAPOSTIPITE Ampicillina Eritromicina Cefazolina Cefuroxime Ceftriaxone Ceftazidime Oxacillina Tetraciclina ANTIBIOTICI EQUIVALENTI Amoxicillina Claritromicina, Azitromicina Cefalosporine I Gen. Cefalosporine II Gen. (Cefuroxime Acetil, Cefaclor) Cefalosporine III Gen. (Cefexime, Cefpodoxime, Ceftibutene, Cefotaxime) Cefoperazone Meticillina, Nafcillina, Cloxacillina Doxicillina, Minociclina

32 Sono inibite dagli inibitori delle betalattamasi (Ac. Clavulanico) RESISTENZE ACQUISITE ESBL Enzimi prodotti da batteri in grado di idrolizzare l anello beta-lattamico delle penicilline, delle cefalosporine (III gen. a spettro esteso) e di altre lattamine, rendendole inattive. I ceppi produttori di betalattamasi a spettro esteso (ESBL) risultano resistenti a: penicilline non protette; cefalosporine; aztreonam.

33 CARBAPENEMASI Enzimi prodotti da batteri con attività idrolitica nei confronti dei carbapenemi, cioè in grado di inattivare molecole quali imipenem, meropenem, ertapenem CARBAPENEMI: - antibiotici betalattamici; - tossicità relativamente bassa; - ampio spettro d azione (con alcune eccezioni, MRSA, E. faecium, ecc.); - fondamentali in infezioni gravi sostenute da Gram negativi MDR fra cui Pseudomonas aeruginosa

34 Un po di storia. Inizi 1990 Fino agli anni isolamenti di MDR produttori carbapenemasi sono per lo più rimasti nosocomiali. Da circa 5-6 anni hanno raggiunto livelli preoccupanti in tutto il mondo (comparsa nuove varianti enzimatiche) Klebsiella pneumoniae (KPC) e altri Enterobatteri (E. coli, Enterobacter spp., ecc): rapida diffusione Batteri produttori di KPC sono stati segnalati in: USA, Cina, America latina, Israele, Grecia, Inghilterra, Polonia, Norvegia, Svezia, ITALIA. Eventi epidemici descritti in Israele e Grecia

35 CARBAPENEMASI caratteristiche genetiche Possono essere codificate sia da: - geni (bla) a localizzazione cromosomiale che da - geni trasferibili (plasmidi e trasposoni) possono trasferirsi fra microrganismi Si ritrovano spesso in associazione con geni che conferiscono multiresistenza (R verso aminoglicosidi, florochinoloni, ESBL)

36 Si distinguono in: CARBAPENEMASI - Metallobetalattamasi (MBL, betalattamasi di classe B) - Carbapenemasi a serina (alcune betalattamasi di classe A e D)

37 CARBAPENEMASI Carbapenemasi tipo MBL: - idrolizzano tutti i betalattamici ad eccezione di aztreonam. - Si conoscono varianti tipo IMP, VIM, SPM, GIM, SIM,KHM,AIM, NDM, DIM, (VIM, NDM isolate in Italia). - Enterobatteri: determinante blavim-1 riscontrato più comunemente (area mediterranea). - MBL di tipo VIM-2: prodotta per lo più da P. aeruginosa; ha superato le altre varianti, molto diffusa. - Enzima NDM-I (New Delhi metallobetalattamasi): recente, emersa in India, rapida diffusione.

38 CARBAPENEMASI Carbapenemasi a serina (classe A e D): - RAPIDA DIFFUSIONE - KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) classe A; - conferiscono scarsa sensibilità o resistenza ai betalattamici; - scarsamente inibite da acido clavulanico e tazobactam (al contrario di ESBL); - Betalattamasi di classe D: più diffuse in Acinetobacter baumanni, anche queste resistenti ad acido clavulanico. Enterobatteri (OXA-48)

39 IN LABORATORIO Quando sospettare la produzione di carbapenemasi? Enterobatteri isolati da qualsiasi campione biologico con MIC >= 0.5 mcg/ml per ertapenem, imipenem o meropenem Tampone rettale per screening enterobatteri produttori di carbapenemasi: in presenza di crescita batterica su terreno selettivo per Gram negativi addizionato di dischetto antibiotico (meropenem 0.5 mcg)

40 Esempio di ceppo batterico produttore di carbapenemasi verosimilmente tipo KPC

41 Alcune riflessioni

42 TAMPONI

43 TAMPONI DI SUPERFICIE Tamponi, ferita, piaga decubito, ulcera, ecc. per ricerca batteri aerobi ed anaerobi Non sono indicati dal momento che tutte le ferite, decubiti anche i non infetti presentano contaminazione batterica; il germe isolato con il tampone spesso non è in relazione con quello che ha determinato la complicanza infettiva. Tampone cutaneo di cute integra: non indicato data l evidente impossibilità di raccogliere materiale.

44 ESITO NEGATIVO: Assenza di flora patogena Ricerca lieviti: negativa TAMPONI DI SUPERFICIE INTERPRETAZIONE Oppure Sviluppo di flora microbica mista senza prevalenza di specie sicuramente patogene Ricerca lieviti: negativa ESITO POSITIVO: Sviluppo di: specie batteriche e o di lieviti se presenti in coltura pura. ANTIBIOGRAMMA: eseguito di routine; no antimicogramma TEMPI DI RISPOSTA: ore

45 TAMPONE NASALE Esame colturale QUESITO DIAGNOSTICO: RICERCA PORTATORI SANI DI Streptococchi beta-emolitici di gruppo A Staphylococcus aureus (MRSA) Neisseria meningitidis RINOSINUSITE??????? Può essere richiesto anche in caso di sinusiti con abbondante presenza di muco purulento per la ricerca di altri patogeni respiratori quali, emofili, pneumococco, Moraxella, di cui, peraltro, non è sempre chiaro il significato del loro reperto come indice predittivo certo della sinusite. Il campione elettivo per diagnosi di sinusite è l aspirato attraverso i seni paranasali.

46 TAMPONE NASALE Esame colturale EZIOLOGIA PREVALENTE: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Branamella catarrhalis ALTRI AGENTI: - Staphylococcus aureus, Streptococchi beta-emolitici, enterobatteri, anaerobi. FLORA COMMENSALE: Stafilococchi, streptococchi, Neisseria spp., emofili, corinebatteri

47 TAMPONE NASALE TIMING DI PRELIEVO: quando possibile, prima della terapia antibiotica MODALITA DI PRELIEVO: - Inserire il tampone in una narice sino a quando si inizia a sentire resistenza ad opera dei turbinati; - Ruotare il tampone contro la mucosa nasale; - Ripetere nell altra narice; - Consegnare in laboratorio il prima possibile; - Conservazione: a T ambiente per 24 ore.

48 ESITO NEGATIVO: Assenza di flora patogena Ricerca lieviti negativa TAMPONE NASALE INTERPRETAZIONE ESITO POSITIVO: Sviluppo di: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, aureus, ALTRE specie batteriche se presenti in coltura pura. Staphylococcus ANTIBIOGRAMMA: eseguito di routine Eccezione per Haemophilus spp. No antimicogramma CONTROLLO DOPO TERAPIA ANTIBIOTICA: Non opportuno in assenza di sintomi. TEMPI DI RISPOSTA: ore

49 TAMPONE AURICOLARE Esame colturale QUESITO DIAGNOSTICO: OTITE ESTERNA, (OTITE MEDIA) EZIOLOGIA PREVALENTE OTITE ESTERNA: - Pseudomonas spp., miceti (prevalenti Candida spp., Aspergillus spp.,), ALTRI AGENTI: - Streptococcus pyogenes, Staphyilococcus aureus FLORA COMMENSALE: Stafilococchi, streptococchi, corinebatteri, lieviti.

50 TAMPONE AURICOLARE Esame colturale QUESITO DIAGNOSTICO: OTITE ESTERNA, (OTITE MEDIA) EZIOLOGIA PREVALENTE OTITE ESTERNA: - Pseudomonas spp., miceti (prevalenti Candida spp., Aspergillus spp.,), ALTRI AGENTI: - Streptococcus pyogenes, Staphyilococcus aureus FLORA COMMENSALE: Stafilococchi, streptococchi, corinebatteri, lieviti.

51 TAMPONE AURICOLARE Esame colturale OTITE MEDIA La diagnosi di otite media può essere formulata unicamente con l analisi del materiale raccolto mediante timpanocentesi: l essudato purulento viene aspirato con siringa attraverso membrana timpanica. In caso di otite media con perforazione del timpano è possibile raccogliere l essudato inserendo un tampone sterile nel condotto uditivo esterno con l utilizzo dell otoscopio. EZIOLOGIA PREVALENTE OTITE MEDIA: -, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococco beta-emolitico, Branamella catarrhalis. ALTRI AGENTI: - Enterobatteri, Staphyilococcus aureus

52 TAMPONE AURICOLARE TIMING DI PRELIEVO OTITE ESTERNA: quando possibile, prima della terapia antibiotica; in presenza di pus o essudato MODALITA DI PRELIEVO OTITE ESTERNA: - Strofinare il tampone nel condotto uditivo esterno; - Consegnare in laboratorio il prima possibile; - Conservazione: a T ambiente per 24 ore. MODALITA DI PRELIEVO OTITE MEDIA (con perforazione timpanica): - Raccogliere l essudato inserendo un tampone sterile nel condotto uditivo esterno con l utilizzo dell otoscopio.

53 TAMPONE AURICOLARE INTERPRETAZIONE ESITO NEGATIVO: Assenza di flora patogena Ricerca lieviti: negativa ESITO POSITIVO: Sviluppo di: specie batteriche (max 2) se presenti in coltura pura. ANTIBIOGRAMMA: eseguito di routine Eccezione per Haemophilus spp., no antimicogramma CONTROLLO DOPO TERAPIA ANTIBIOTICA: Non opportuno in assenza di sintomi. TEMPI DI RISPOSTA: ore

54 TAMPONE FARINGEO Esame colturale QUESITO DIAGNOSTICO principale: FARINGOTONSILLITE EZIOLOGIA PREVALENTE FARINGOTONSILLITE: - Streptococco beta-emolitico di Gr. A, (Streptococcus pyogenes) ALTRI AGENTI: - Streptococchi beta-emolitici di Gr. C (es. Streptococcus equi) e Gr. G (Streptococcus dysagalactiae, S. anginosus). FLORA COMMENSALE (cavità orale, orofaringe, rinofaringe): Stafilococchi (cons), streptococchi alfa-emolitici, Neisseria spp., emofili, actinomiceti, Candida spp., enterobatteri.

55 TAMPONE FARINGEO TIMING DI PRELIEVO: durante la sintomatologia MODALITA DI PRELIEVO: - Usare un tampone sterile con terreno di trasporto; - Utilizzando un abbassalingua comprimere delicatamente la lingua sul pavimento della bocca; - Inserire il tampone tra le tonsille, al di sotto dell ugola, evitando di toccare la mucosa delle guance, la lingua, l ugola, le labbra che sono fortemente colonizzate dalla flora commensale; - Strofinare o ruotare vigorosamente il tampone sul retrofaringe. - Inserire il tampone nel terreno di trasporto; - Consegnare in laboratorio il prima possibile; - Conservazione: a T ambiente per 24 ore.

56 ESITO NEGATIVO: TAMPONE FARINGEO INTERPRETAZIONE nessuno sviluppo di streptococco beta-emolitico ESITO POSITIVO: Sviluppo di: Streptococcus pyogenes TEMPI DI RISPOSTA: ore PORTATORE SANO: Solitamente bambini (sup. al 20%; percentuale più bassa per adulti). ANTIBIOGRAMMA: eseguito SOLO su richiesta Eseguito per scopi epidemiologici e per valutare la resistenza verso farmaci di 2 scelta (macrolidi) CONTROLLO DOPO TERAPIA ANTIBIOTICA: Non opportuno in assenza di sintomi.

57 TEST RAPIDO (RAD: Rapid Antigen Detection test) Primi test (anni 80) con metodica di agglutinazione su latex: bassa sensibilità. Test più diffusi sono di seconda generazione: metodica EIA (immunoenzimatica); sensibilità e specificità migliori dei precedenti L ultima generazione di test (metodica immuno-ottica) ha mostrato in singoli studi di validazione, una sensibilità quasi equivalente all esame colturale; ancora poco utilizzata (Gerber, Shulman, 2004). L accuartezza del test dipende da: - esperienza di chi esegue il test e collaborazione del bambino; - gold standard contro cui si compara la performance del test (esame colturale); - tipo di test usato (a parità di metodica le varie ditte producono test con sensibilità e specificità diverse). Linea guida regionale Dossier ASR Faringotonsillite in età pediatrica

58 TEST RAPIDO (RAD: Rapid Antigen Detection test) In sintesi la maggior parte dei test attualmente usati presenta: - sensibilità < al 95% (Gerber, Shulman, 2004; MHRA, 2005) - Specificità > al 95% (Gerber, Shulman, 2004; MHRA, 2005) Strep A + strip Ditta ABS Sensibilità: 94.7% Specificità: 99.2% IN USO KIT PER ESECUZIONE TAMPONE FARINGEO metodica: immunocromatografia Quindi se il test rapido è NEGATIVO: su 100 bambini almeno 5 potranno risultare falsi negativi. Al contrario, Se il test rapido è POSITIVO si può essere sufficientemente sicuri della diagnosi. Il rischio di un falso positivo è inf. al 1%.

59 TEST RAPIDO (RAD: Rapid Antigen Detection test) Da non dimenticare: Il test potrebbe restare positivo anche dopo la terapia antibiotica in quanto rivelatore di Ag. Non eseguire il test come controllo post terapia.

60 FARINGO-TONSILLITE EZIOLOGIA PREVALENTE di altra natura - Rhinovirus; - Virus parainfluenzali 1,2,3; virus influenzali A,B; Adenovirus; ALTRI AGENTI - M. pneumoniae, C. pneumoniae (PCR) da tampone, aspirato naso faringeo e da siero; - EBV sierologia. Esami di base : - ricerca IgM di M. pneumoniae su siero. - EBV sierologia Di secondo livello Ricerca RNA virus influenzali A,B in t. faringeo Ricerca DNA M. pneumoniae in t. faringeo

61 TAMPONE CAVO ORALE TIMING DI PRELIEVO: - quando possibile, prima della terapia antibiotica; - In acuzie MODALITA DI PRELIEVO: - Strofinare il tampone sulle aree interessate del cavo orale; - Consegnare in laboratorio il prima possibile; - Conservazione: a T ambiente per 24 ore.

62 TAMPONE CAVO ORALE INTERPRETAZIONE ESITO NEGATIVO: Sviluppo di flora microbica mista del cavo orale Ricerca miceti: negativa ESITO POSITIVO: Sviluppo di: Candida spp. ANTIBIOGRAMMA: NON eseguito di routine CONTROLLO DOPO TERAPIA ANTIBIOTICA: Non opportuno in assenza di sintomi. TEMPI DI RISPOSTA: ore

63 APPARATO GASTRO-ENTERICO Diagnosi eziologica di GASTROENTERITE INFETTIVA Si può ipotizzare una diarrea infettiva quando vengono emesse almeno 5 scariche nell arco di un unica giornata o almeno 3 scariche al giorno per 3 giorni consecutivi. AGENTE PATOGENO: BATTERI: - COPROCOLTURA - FECI per RICERCA Clostridium difficile (Ag+tox) VIRUS: - FECI RICERCA DIRETTA Ag PARASSITI: - FECI, RICERCA MICROSCOPICA previo arricchimento (uova, cisti, proglottidi ecc.) - SCOTCH TEST per RICERCA OSSIURI - FECI, RICERCA Ag. E. histolytica, Giardia

64 EZIOLOGIA PREVALENTE: - Salmonella spp. - Shigella spp. - Campylobacter jejuni. COPROCOLTURA per ricerca BATTERI Il laboratorio esegue: COPROCOLTURA DI ROUTINE che PREVEDE LA RICERCA di: Salmonella, Shigella e Campylobacter ALTRI AGENTI (vanno espressamente richiesti): Yersinia enterocolitica, Aeromonas spp. (pz ospedalizzati, immunodepressi), E. coli enterotossici (ETEC), E. coli enteroinvasivi (EIEC), E. coli enteropatogeni (EPEC), Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, ecc.

65 TIMING DI PRELIEVO: in presenza di feci diarroiche COPROCOLTURA MODALITA DI PRELIEVO: Predisporre un contenitore pulito in cui raccogliere le feci Stappare il contenitore dedicato PARA-PAK C&S e con la palettina del tappo introdurre nel liquido parte delle feci, finché il liquido non raggiunge il livello (riga) indicato nell etichetta del contenitore. Qualora si rilevasse la presenza di sangue e/o di muco, introdurre nel liquido anche parte di queste sostanze. Chiudere il contenitore avvitando bene il tappo e agitarlo energicamente Per la raccolta utilizzare solo i contenitori consegnati; conservare a temperatura ambiente, non refrigerare.

66 ESITO NEGATIVO: COPROCOLTURA INTERPRETAZIONE Nessuno sviluppo di Salmonella e Shigella Ricerca Campylobacter: negativa ESITO POSITIVO: Sviluppo di: Salmonella di gr.. Sviluppo di: Shigella spp. Sviluppo di: Campylobacter spp. ANTIBIOGRAMMA: NON eseguito di routine Per Salmonella spp. eseguito SOLO su richiesta CONTROLLO DOPO eventuale TERAPIA ANTIBIOTICA: Non opportuno in assenza di sintomi. TEMPI DI RISPOSTA: ore

67 FECI per RICERCA Clostridium difficile QUESITO DIAGNOSTICO: DIARREA ASSOCIATA AD ANTIBIOTICI, ENTERITE PSEUDOMEMBRANOSA Il nostro laboratorio esegue: - RICERCA nelle feci di Ag e Tossine (A,B) TIMING DI PRELIEVO: - raccolta feci diarroiche (feci non formate) MODALITA DI PRELIEVO - raccogliere feci emesse spontaneamente NON FORMATE (feci formate e tampone rettale sono campioni NON idonei ); - conservare in frigorifero per massimo 24 ore.

68 ESITO NEGATIVO: Ricerca Ag: NEGATIVA FECI per RICERCA Clostridium difficile INTERPRETAZIONE Ricerca Tossine A e B: NEGATIVA ESITO POSITIVO: Ricerca Ag: POSITIVA Ricerca Tossine A e B: POSITIVA Ricerca Ag: POSITIVA Ricerca Tossine A e B: NEGATIVA TEMPI DI RISPOSTA: 24 ore SOLO I CEPPI PRODUTTORI DI TOSSINE HANNO UN RUOLO PATOGENO Fino al 70% dei bambini di età inferiore a 1 anno possono essere portatoti sani

69 FECI RICERCA DIRETTA Ag. VIRALI QUESITO DIAGNOSTICO: GASTROENTERITE ACUTA FEBBRILE - Rotavirus - Adenovirus EZIOLOGIA PREVALENTE: Il nostro laboratorio esegue su richiesta: Rotavirus, Adenovirus Test qualitativo immunocromatografico rapido Sensibilità: Rotavirus : 96.3% Adenovirus: 98% Specificità: 99% per entrambi ALTRI AGENTI Astrovirus, Norovirus, Enterovirus

70 FECI RICERCA DIRETTA Ag. VIRALI TIMING DI PRELIEVO: In fase di acuzie MODALITA DI PRELIEVO E CONSERVAZIONE - raccogliere un campione di feci in contenitore sterile senza conservante (tappo rosso) - Consegnare in laboratorio il prima possibile. - Conservare in frigorifero (T +4 C) per max 24 ore.

71 ESITO NEGATIVO: FECI RICERCA DIRETTA Ag. VIRALI INTERPRETAZIONE Ricerca Rotavirus esito: NEGATIVO Ricerca Adenovirus esito: NEGATIVO ESITO POSITIVO: Ricerca Rotavirus esito: POSITIVO Ricerca Adenovirus esito : POSITIVO TEMPI DI RISPOSTA: 24 ore Ricordando che Sensibilità: Rotavirus : 96.3% Adenovirus: 98% Specificità: 99% per entrambi

72 FECI: RICERCA MICETI Quesito Diagnostico:??? ESITO NEGATIVO negativo ESITO POSITIVO: Sviluppo di: Candida albicans o not albicans Frequente colonizzante intestinale il cui riscontro nelle feci non assume solitamente significato patologico. TEMPI DI RISPOSTA: 48 ore

73 RICERCA PARASSITI INTESTINALI QUESITO DIAGNOSTICO: ENTERITE ACUTA O PROTRATTA, DIARREA DEL VIAGGIATORE, COLITE AMEBICA, DISTURBI DELL ALVO, ecc. EZIOLOGIA PREVALENTE: - PROTOZOI: Giardia intestinalis, entamoeba histolytica, Dientamoeba fragilis, Isospora belli, Balantidium coli, Blastocistys hominis. - ELMINTI: Hymenolepis nana, Tenie, Trichuris trichiura, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis. Il laboratorio esegue: - ricerca microscopica diretta previa concentrazione; - Scotch test Indagini di secondo livello: Ricerca antigenica per: Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium parvum

74 FECI RICERCA PARASSITI INTESTINALI TIMING DI PRELIEVO: - Variabile - Si consiglia di raccogliere 3 campioni di feci in giorni diversi (l eliminazione di alcuni parassiti non è giornaliera) MODALITA DI PRELIEVO E CONSERVAZIONE Predisporre un contenitore pulito in cui raccogliere le feci Stappare il contenitore e con la palettina del tappo introdurre nel liquido parte delle feci, finché il liquido non raggiunge il livello (linea nera) indicato nell etichetta del contenitore. Qualora si rilevasse la presenza di sangue e/o di muco, introdurre nel liquido anche parte di queste sostanze. Chiudere il contenitore avvitando bene il tappo e agitarlo energicamente Se il materiale non può essere consegnato subito al Centro Prelievi va conservato in frigorifero per massimo 24 ore. Per la raccolta utilizzare solo i contenitori consegnati.

75 ESITO NEGATIVO: FECI RICERCA PARASSITI INTESTINALI INTERPRETAZIONE Esame microscopico diretto dopo concentrazione con etilacetato NEGATIVO ESITO POSITIVO: Esame microscopico diretto previo arricchimento POSITIVO Presenza di cisti di Presenza di uova o forme adulte di

76 RICERCA OSSIURI SCOTCH TEST TIMING DI PRELIEVO: In acuzie MODALITA DI PRELIEVO E CONSERVAZIONE - Al mattino, al risveglio del paziente, senza preventiva alcuna igiene locale applicare in zona perianale uno scotch trasparente della lunghezza di 5-6 cm per alcuni minuti, esercitando una leggera pressione. Staccarlo e stenderlo sul vetrino evitando bolle o rigonfiamenti. - Consegnare in mattinata - SCOTCH TEST: NEGATIVO (per uova di Enteribius vermicularis) SCOTCH TEST: POSITIVO presenza di uova di Enteribius vermicularis

77 TEST di Helicobacter pylori IN CAMPIONI FECALI QUESITO DIAGNOSTICO: INFEZIONE DA Helicobacter pylori Test IMMUENZIMATICO per la ricerca qualitativa degli Ag di Helicobacter pylori MODALITA DI PRELIEVO E CONSERVAZIONE - Non assumere nelle 2 settimane precedenti l esecuzione del test: antimicrobici, inibitori di pompa, preparati a base di bismuto; - raccogliere il campione in contenitore sterile a secco; - consegnare in laboratorio il prima possibile; - conservare in frigorifero (T +4 C) per max 24 ore.

78 TEST IMMUNOLOGICO RAPIDO RILEVAZIONE Ag di Helicobacter pylori IN CAMPIONI FECALI SI RICORDA CHE Se il test viene utilizzato per il controllo dell eradicazione della malattia devono passare almeno 8 settimane dalla fine della terapia. Si evitano così falsi positivi in quanto l antigene continua ad essere eliminato per almeno 2 mesi.

79 TAMPONE VAGINO-RETTALE - Eseguito alle pazienti in gravidanza tra la settimana di gestazione - Ricerca di Streptococco betaemolitico di gruppo B (Streptococcus agalactiae) responsabile di sepsi neonatali precoci e tardive. - Esecuzione dell antibiogramma di routine - Richiesta specifica di tampone vagino-rettale

80 TAMPONE VAGINO-RETTALE INTERPRETAZIONE - ESITO NEGATIVO: Negativo per ricerca streptococco betaemolitico di GR. B - ESITO POSITIVO: Sviluppo di Streptococcus agalactiae Antibiogramma: di aiuto in caso di pazienti allergiche alle penicilline

81 TAMPONE VAGINALE QUESITO DIAGNOSTICO: VAGINITE EZIOLOGIA PREVALENTE: - Trichomonas vaginalis, Candida albicans e altre specie, Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes (più frequente in età pediatrica) ALTRI AGENTI: - Listeria monocytogenes FLORA COMMENSALE: Streptococchi, stafilococchi (Cons), enterobatteri, Corinebatteri, ecc. Esame colturale + valutazione microscopica dopo colorazione di Gram

82 TAMPONE VAGINALE ESITO NEGATIVO: Sviluppo di flora vaginale normale o nessuno sviluppo di flora batterica Ricerca Trichomonas vaginalis., Gradnerella vaginalis: negativa Ricerca lieviti negativa ESITO POSITIVO: Ricerca T.cvaginalis o G. vaginalis: positiva o Sviluppo di: Candida albicans o Candida spp. Not albicans Segnalazione di enterobatteri Antibiogramma non eseguito di routine SOLO su richiesta Nessun controllo dopo terapia

83 EMOCOLTURE

84 Corretta esecuzione delle indagini microbiologiche Emocoltura: Coltura di un campione di sangue ottenuto da una singola venipuntura. La corretta sequenza dei flaconi è: Aerobi Anaerobi Miceti

85 Corretta esecuzione delle indagini microbiologiche EMOCOLTURA Raccomandazioni L emocoltura è uno degli esami più importanti in microbiologia sia per la sua rilevanza clinica sia per l importanza diagnostica ed epidemiologica. 1) Praticare il prelievo prima dell inizio della terapia antibiotica, se ciò non fosse possibile segnalare sulla scheda se il paziente è in terapia. Una terapia in atto riduce la possibilità di isolamento batterico.

86 Corretta esecuzione delle indagini microbiologiche EMOCOLTURA 2) Eseguire il prelievo prima della puntata febbrile, minuti prima è il momento in cui il numero dei batteri nel sangue è maggiore. Se non è prevedibile eseguire il prelievo all inizio del rialzo febbrile. 3) Seguire attentamente le modalità previste per il prelievo al fine di evitare la contaminazione esogena del campione, causa di difficoltà interpretative del risultato stesso. N.B. Infatti la flora cutanea (es. S. epidermidis) può inquinare il campione e produrre FALSI POSITIVI alla coltura.

87 Raccomandazioni Se si sospetta una sepsi è sufficiente prelevare simultaneamente 2 set di emocolture.

88 Raccomandazioni Le emocolture dovrebbero essere ottenute da vena periferica, adottando protocolli di antisepsi cutanea e di prelievo dei campioni in grado di minimizzare il rischio di contaminazione. I flaconi inoculati devono essere consegnati al laboratorio dalle ore 8 alle ore 19,30 di ogni giorno oppure conservati a TEMPERATURA AMBIENTE fino al momento della consegna.

89 Raccomandazioni In tutti i pz con sospetta sepsi, le emocolture devono essere eseguite il prima possibile dall insorgenza della sintomatologia come ad es. febbre o brivido. Se si sospetta una infezione correlata al CVC, devono essere prelevati simultaneamente 2 set di emocolture: 1 da vena periferica ed 1 da CVC.

90 Raccomandazioni La sorveglianza routinaria, tramite tamponi periodici, non è raccomandata. La frequenza di colonizzazione microbica aumenta con il tempo di permanenza del CVC.

91 Raccomandazioni Quando si sospetta che un CVC sia la causa della sepsi in un pz non batteriemico, il CVC deve essere rimosso ed inviato per l esecuzione della coltura, al fine di ottenere diagnosi certa.

92 BIBLIOGRAFIA - Indicazioni pratiche e protocolli operativi per la diagnosi, la sorveglianza e il controllo degli enterobatteri produttori di carbapenemasi nelle strutture sanitarie e socio sanitarie. Documento regionale ASR Luglio Controllo degli enterobatteri produttori di carbapenemasi in Emilia-Romagna. Documento regionale ASR Migliavacca R., Pan A., Gagliotti C., Sarti M.. Le carbapenemasi: un problema di antibiotico resistenza in preoccupante evoluzione. GimPIOS -vol 1, n.2, aprile-giugno 2011 e relativa bibliografia. -WWW. amcli.it percorsi diagnostici

93 BIBLIOGRAFIA Murray PR eds. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington DC: American Society for Microbiology Press, Rex JH et al Clin Infect Dis 1997; 24: Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Clinical and Laboratory Standard Institute, Wayne, Pa. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Clinical and Laboratory Standard Institute, Wayne, Pa. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Fifteenth Informational Supplement. Dossier Sistema regionale dell Emilia-Romagna per la sorveglianza dell antibioticoresistenza Murray PR eds. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington DC: American Society for Microbiology Press, L. Paterson D. et al Extended-Spectrum ß-lactamase: a clinical Update. Clin. Microb. Rev. 2005:18 (4): Istruzione operativa IO10RTIO32: Prevenzione e sorveglianza delle infezioni da cateterismo vescicale, AUSL di Reggio Emilia 3/11/2005.