Fulvio Prof. Magni Corso di laurea di Tecnici di Laboratorio BioMedico III anno. Scopo

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1 Scienze Tecniche di Medicina e di Laboratorio Fulvio Prof. Magni Corso di laurea di Tecnici di Laboratorio BioMedico III anno Scopo Messa a punto di un metodo analitico per valutazioni: - Qualitative - Quantitative

2 DOSAGGI QUALI-QUANTITATIVI Immunometriche Chimico-fisiche Immuno-enzimatiche EIA Enzyme Immuno-assay ELISA Enzyme-linked immunoassay EMIT Enzyme multiplied immunoassay FIA Immuno fluorimetriche EPIA Immuno fluorimetriche a luce polarizzata Radioisotopiche RIA Radio Immunologiche Immuno-luminescenti Cromatografiche Spettrografiche CL Chemiluminescenti BL Bioluminescenti LIA Luminescenti Su carta Su colonna TLC GLC (GC) HPLC Fotometria a fiamma Assorbimento atomico Ultravioletto Fluorimetria Infrarosso Risonanza magnetica Spettrometria di massa

3 Caratteristiche di un metodo: 1. Veloce 2. Accurato 3. Specifico 4. Sensibile 5. Preciso 6. Basso costo Se quantitativo Cosa devo quantificare Qual è la metodica migliore Qual è il composto di riferimento migliore Disporre dell analita puro

4 Sviluppo di un metodo quali/quantitativo Preparazione del campione 1- Aliquotazione 2- Eventuale aggiunta del composto di riferimento Analita in presenza di matrice Purificazione-concentrazione: 1- Estrazione 2- Cromatografia 3- Derivatizzazione Analita senza/ridotta presenza di matrice Analisi strumentale 1- Separazione GC /HPLC 2- Registrazione segnale (rivelatore: UV-FID-ECD-SM) Elaborazione dei dati

5 Procedura per l analisi quali/quantitativa. Analita puro Composto di riferimento Curva di calibrazione Singolo-Più punti Campione biologico ESTRAZIONE PURIFICAZIONE Modificazione chimica ANALISI STRUMENTALE

6 Preparazione del campione Omogeneizzazione: il campione deve essere reso omogeneo in tutte le sue parti, quando viene usato per l analisi (scongelamento totale, agitazione, sonicatura, ecc.) Prelievo: la quantità di campione (aliquota) deve essere dispensata (misurata) accuratamente e deve essere rappresentativa del campione (omogenea rispetto al resto). Eventuale aggiunta del composto di riferimento (I.S.): addizionato con elevata precisione sciolto in un solvente compatibile con la matrice del campione (non altera il campione, es deproteinizzazione). minimo volume di aggiunta. Equilibrazione: deve permettere una completa diffusione e scambio dell analita con il IS, in modo da evitare differenze nella estrazione dalla matrice.

7 Intensità Intensità Procedimento di confronto tra due segnali: quello derivante dalla miscela in esame con l analogo segnale ottenuto da una eguale miscela di riferimento (STANDARD) contenente una concentrazione nota dell analita da valutare. L analisi del campione contenente il composto di riferimento serve a determinare la relazione tra concentrazione/quantità di analita analizzata e intensità del segnale. [A] ANALISI QUANTITATIVA 1-analisi del Campione di riferimento Analisi strumentale [A]= f x I A f= [A] / I A 2- analisi della miscela incognita I A [X] Analisi strumentale [X]= f x I X I X

8 Intensità Intensità ANALISI QUANTITATIVA Procedimento di confronto tra due segnali: quello derivante dalla miscela in esame con l analogo segnale ottenuto da una eguale miscela contenente una concentrazione nota dell analita da valutare. [A] Analisi strumentale A [A] + [B] Analisi strumentale A B

9 Messa a punto di un metodo (se quantitativo) Valutazione quantitativa utilizzando Composto di riferimento (standard) esterno: -Esterno al campione contenente l analita: il composto di riferimento (Std. Ext.) e l analita non sono presenti contemporaneamente in tutti i passaggi analitici a cui è sottoposto il campione. Composto di riferimento (standard) interno: - Interno al campione contenente l analita: il composto di riferimento (Std. ) e l analita sono presenti contemporaneamente in tutti i passaggi analitici a cui è sottoposto il campione.

10 Messa a punto di un metodo (se quantitativo) Valutazione quantitativa utilizzando Composto di riferimento (standard) esterno: 1. -Analita puro analizzato nelle stesse condizioni del campione. 2. -Analita puro addizionato alla matrice il più possibile simile a quella del campione (siero, plasma, urine ecc.). 3. -Composto addizionato alla matrice con diverso comportamento cromatografico prima della analisi strumentale. Composto di riferimento (standard) interno: -Viene addizionato al campione prima di ogni manipolazione. -Composto il più possibile simile all analita per struttura chimica o comunque con comportamento cromatografico simile addizionato al campione

11 Standard esterno C A B C Campione semplice Sistema di rilevazione Campione complesso rilevatore specifico C A B C A B C Sistema di separazione C B A Sistema di rilevazione

12 Standard esterno 1-Il composto di riferimento esterno viene analizzato separatamente (con/senza nessun passaggio di purificazione). Può essere lo stesso analita. Std. Ext. (= analita) Campione con l analita

13 Standard esterno 2- Viene aggiunto alla matrice (identica a quella in cui vi è l analita da quantificare) priva dell analita (prima dei vari passaggi di purificazione). - Permette la quantificazione dell analita rendendola indipendente dalle variazioni strumentali e dall effetto della matrice (recuperi). - Può essere lo stesso analita. - Non deve essere presente nella matrice. Matrice senza analita Matrice+Std.Est. Matrice con l analita

14 Standard esterno (ricade nel campo dello S.I.) 3-Viene aggiunto al campione (dopo i vari passaggi di purificazione) nello stadio immediatamente precedente la determinazione quantitativa strumentale (es. prima dell iniezione in GC). -Permette la quantificazione dell analita rendendola indipendente dalle variazioni strumentali o dal volume iniettato. -Può essere un composto con struttura completamente differente da quella dell analita. -Deve essere distinguibile dall analita durante l analisi strumentale (es: avere un diverso comportamento cromatografico, assorbimento S. ad una diversa lunghezza A. d onda). min.

15 Standard esterno 1-SENZA MATRICE: Il composto di riferimento esterno viene analizzato separatamente (con/senza nessun passaggio di purificazione). Può essere lo stesso analita. 2-CON MATRICE: Viene aggiunto al campione (dopo i vari passaggi di purificazione) nello stadio immediatamente precedente la determinazione quantitativa (es. prima dell iniezione in GC). -Permette la quantificazione dell analita rendendola indipendente dalle variazioni strumentali o dal volume iniettato. -Può essere un composto con struttura completamente differente da quella dell analita. -Deve avere un diverso comportamento cromatografico. 3-NEL CAMPIONE: Viene aggiunto alla matrice (identica a quella in cui vi è l analita da quantificare) priva dell analita (prima dei vari passaggi di purificazione). -Permette la quantificazione dell analita rendendola indipendente dalle variazioni strumentali e dall effetto della matrice (recuperi). -Può essere lo stesso analita. -Non deve essere presente nella matrice.

16 1 L siero = 10 ng SE 1 L siero = YY ng Analita Se analizzo 1/100 di campione: 1/100 SE = 0.1 ng 10 Volt 1/100 ANALITA =x ng XX volt

17 ANALISI QUANTITATIVA (Std. Ext.) Calcolo della concentrazione del campione SINGOLO PUNTO Std. Ext. (= analita) Campione con l analita 1-Si identifica il picco al tempo di ritenzione (rt). 2-Si valuta l area del picco nel campione Ac. 3-Si valuta l area del picco dello standard As con concentrazione nota Cs. 4-Si calcola la concentrazione nel campione. As = f [Std. Ext.] Ac = f [Analita] As : Cs = Ac : Cc Cc= Cs x Ac/As

18 ANALISI QUANTITATIVA (Std. Ext.) Calcolo della concentrazione del campione SINGOLO PUNTO 1-Si identifica il picco al tempo di ritenzione (rt). 2-Si valuta l area del picco nel campione Ac. 3-Si valuta l area del picco dello standard As con concentrazione nota Cs. Campione X mol/l Soluzione analita puro 2 mol/l 4-Si calcola la concentrazione nel campione. Ac=10 unità (Area picco) As=15 unità (Area picco) Cc : Cs = Ac : As Cc= Cs x Ac/As Cc : Cs = Ac : As Cc = 2 x [10 / 15]

19 ANALISI QUANTITATIVA (Std. Ext.) Calcolo della concentrazione del campione CURVA DI CALIBRAZIONE 1-Si preparano e si analizzano soluzioni a concentrazione nota di analita puro (in presenza o assenza di matrice). 2-Iniettando sempre lo stesso volume di soluzione si ottengono cromatogrammi con area crescente per il picco derivante dall analita. 3-Si integra l area del picco (o altezza). 4-Si costruisce la curva di calibrazione.

20 ANALISI QUANTITATIVA Standard ESTERNO Curva di calibrazione Campione Ac Curva [mol/l] Area (unità) , , , ,8 Camp.? 15,07

21 Intensità segnale (Area) ANALISI QUANTITATIVA Standard ESTERNO Y = a + bx Y= area X=conc. Retta teorica Y = 0 + 0,25X r 2 = 1 Retta calcolata Y = 0,07 + 0,247X r 2 = 0,9995 Calcolo della [X] Ac = area del picco dell analita nel campione Cc = conc. dell analita nel campione Cc = (Ac - 0,07) / 0,247 = (15,07-0,07)/0,247 = 60, y = 0,247x + 0,07 R 2 = 0, M

22 Metodo quantitativo con STD. INT: Valutazione quantitativa utilizzando Composto di riferimento (standard) interno: - Interno al campione contenente l analita: il composto di riferimento (Std. ) e l analita sono presenti contemporaneamente in tutti i passaggi analitici a cui è sottoposto il campione.

23 Messa a punto di un metodo (se quantitativo) Valutazione quantitativa utilizzando Composto di riferimento (standard) interno: -Viene addizionato al campione prima di ogni manipolazione. -Composto il più possibile simile all analita per struttura chimica o comunque con comportamento cromatografico simile addizionato al campione

24 ANALISI QUANTITATIVA (Std. ) Deve essere un composto con struttura e comportamento chimicofisico il più possibile simile all analita MA DEVE ESSERE DISTINGUIBILE dall analita (es: diverso tempo di ritenzione, assorbimento ad una diversa lunghezza d onda, diverso spettro di massa = ioni con diverso valore di m/z). Viene aggiunto al campione contenente l analita prima di qualsiasi manipolazione del campione, ad eccezione della sola aliquotazione (suddivisione del campione in aliquote a volume noto), e subisce gli stessi passaggi di estrazione, purificazione e trasformazione chimica dell analita. Permette di valutare le variazioni che il processo analitico causa e che si rifletterebbero sul risultato (quantitative) e quindi di correggerle. Permette la quantificazione dell analita rendendola indipendente da molte delle possibili variazioni del metodo di analisi.

25 ANALISI QUANTITATIVA (Std. ) Viene aggiunto in quantità identiche al campione ed alla curva di calibrazione (singolo più punti). Per il calcolo utilizzo il rapporto tra l intensità (area o altezza) del segnale dell analita e dello Std. ng analita+std. Area analita+std.int R Tutto OK! 100ng + 100ng Recupero 50% 100ng + 100ng Recupero 25% 100ng + 100ng 12,5 + 12,5 1

26 ANALISI QUANTITATIVA Standard INTERNO 1 Omologhi della stessa serie Molecole simili Isomeri NON DEVONO ESSERE PRESENTI NELLA MATRICE 2 Radioisotopi ( 3 H, 14 C) per il calcolo dei recuperi + Std.est. / int. per il calcolo quantitativo 3 Isotopi stabili standard ideale

27 ANALISI QUANTITATIVA Standard INTERNO Calcolo della concentrazione del campione SINGOLO PUNTO IS: composto diverso dall analita aggiunto al campione. Caratteristiche chimico-fisiche il più possibile simili all analita. Distinguibile dall analita (diverso r.t.). Nessun segnale Analita + IS Matrice Matrice + IS

28 ANALISI QUANTITATIVA Standard INTERNO Calcolo della concentrazione del campione CURVA DI CALIBRAZIONE Campione Ac As Curva di calibrazione Curva IS Analita IS Analita [mol/l] Area (unità) , ,1 2, ,9 5, ,2 9, ,9 19,8 Campione 100 x 10,0 10,0

29 ANALISI QUANTITATIVA Standard INTERNO Curva di calibrazione Curva IS Analita IS Analita Rapporti [mol/l] Area (unità) [Cc]/[Cs] Ac / As , , ,1 2,4 0,1 0, ,9 5,3 0,2 0, ,2 9,9 0,4 0, ,9 19,8 0,8 2,00 Camp 100 X 10,0 10,0 x 1,0 Ac As Calcolo la funzione che lega l intensità del segnale con la concentrazione utilizzando i rapporti tra segnali.

30 Ac / As Ac / As ANALISI QUANTITATIVA (Std. ) Y = 0, ,0249X Y = 0, ,49X 2,50 y = 0,0249x + 0,0017 R 2 = 0,9991 2,50 y = 2,49x + 0,0017 R 2 = 0,9991 2,00 1,50 1,00 0,50 0, [Cc] 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 [Cc] / [Cs] Ac / As = 1 [IS] = 100 [Cc] = (1-0,0017)/0,0249 = 40,1 [Cc] = (1-0,0017)/2,49 x 100 = 40,1

31 Curve di calibrazione In una curva di calibrazione vengono riportati in ascisse le concentrazioni o il rapporto delle concentrazioni ed in ordinate i rapporti delle aree. Si possono avere 4 tipi di curve di calibrazione: analita Standard Nessuna interferenza reciproca Interferenza dell analita sullo std.

32 Curve di calibrazione In una curva di calibrazione vengono riportati in ascisse le concentrazioni o il rapporto delle concentrazioni ed in ordinate i rapporti delle aree. Si possono avere 4 tipi di curve di calibrazione: analita Standard Interferenza dello std. sull analita. Standard Interferenza reciproca.

33 Curve di calibrazione In una curva di calibrazione vengono riportati in ascisse le concentrazioni o il rapporto delle concentrazioni ed in ordinate i rapporti delle aree. Si possono avere 4 tipi di curve di calibrazione: 1-se non vi sono interferenze reciproche tra analita ed il suo standard interno la curva è: lineare e intercetta = 0. 2-se lo IS contribuisce al segnale dell analita ma non viceversa la curva è: lineare e con intercetta positiva 1,2 y = 0,02x + 0,1 R 2 = 1 1,4 y = 0,02x + 0,3 R 2 = 1 1 0,8 1,2 1 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,

34 Curve di calibrazione In una curva di calibrazione vengono riportati in ascisse le concentrazioni o il rapporto delle concentrazioni ed in ordinate i rapporti delle aree. Si possono avere 4 tipi di curve di calibrazione: 3-se l analita interferisce con il segnale dello IS allora la curva è: Curvilinea e intercetta = 0. 4-se vi è una reciproca interazione tra analita e IS allora la curva è: curvilinea e non passante per l origine. 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0132x + 0,0384 R 2 = 0, ,200 1,100 1,000 0,900 0,800 0,700 0,600 0,

35 ANALISI QUANTITATIVA Metodo dell'incremento Aggiunta dell analita in quantità crescenti al campione.