MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

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Regina Vitali
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1 MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

2 Microscopia a fluorescenza Fluorescenza Capacità di assorbire radiazioni elettromagnetiche di una certa lunghezza d'onda e di emettere una frazione dell energia assorbita con radiazione elettromagnetiche di una lunghezza d onda differente e superiore a quella assorbita. Microscopia a fluorescenza Usa la luce ultravioletta, a una lunghezza d onda nanometri le strutture sono analizzate in base alla fluorescenza che emettono nello spettro visibile. AUTOFLUORESCENZA Prodotta da sostanze normalmente presenti nel tessuto. Es: citoplasma (debole luce bluastra), i granuli (intensa luce giallognola), e i mitocondri (forte emissione fluorescente). Il nucleo, al contrario, non è autofluorecente. FLUORESCENZA SECONDARIA Indotta da una colorazione con sostanze fluorescenti, dette fluorocromi (fluoresceina o rodamina).

famiglia di coloranti che evidenziano il DNA al microscopio a

3 Microscopia a fluorescenza Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON HOECHST Il colorante HOECHST fa parte della famiglia di coloranti che evidenziano il DNA al microscopio a fluorescenza. Pertanto è utilizzato per visualizzare i nuclei e i mitocondri.

4 Microscopia a fluorescenza Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA L arancio di acridina è un colorante fluorescente per gli acidi nucleici. In particolare colora in verde il DNA e in rosso l RNA

5 Microscopia a fluorescenza Immunofluorescenza UTILIZZO DI ANTICORPI MARCATI CON UNA SOSTANZA FLUORESCENTE TRATTAMENTO DELLE SEZIONI ISTOLOGICHE CON GLI ANTICORPI MARCATI OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA METODO DIRETTO La sostanza fluorescente è legata direttamente all anticorpo prodotto contro l antigene cercato. METODO INDIRETTO Anticorpo primario che riconosce l antigene cercato. Antcorpo secondario, a cui è legata la sostanza fluorescente, che riconosce l anticorpo primario

6 Microscopia a fluorescenza Immunofluorescenza modello di membrana a mosaico fluido - ESTRAZIONE proteine di membrana - INOCULAZIONE in conigli diversi - ESTRAZIONE dei 2 tipi di anticorpi - MARCATURA differenziale anticorpi - FUSIONE CELLULARE (Virus Sendai) - TRATTAMENTO con i due anticorpi - OSSERVAZIONE della marcatura al microscopio a fluorescenza Topo Uomo

7 Microscopia a fluorescenza Immunofluorescenza

8 MICROSCOPIA ELETTRONICA

9 Microscopia elettronica Limite di risoluzione molto più elevato di quello ottico Non viene utilizzata la luce per rivelare il preparato, ma un fascio di elettroni accelerato fortemente Immagini ultrastrutturali del preparato in bianco e nero, e non colorate come nella microscopia ottica 1) MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE Il preparato è sezionato e sono visualizzate le strutture interne 2) MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE Il preparato NON è sezionato e sono visualizzate le strutture esterne, quindi la struttura tridimensionale del campione

10 Microscopia elettronica a trasmissione filamento (catodo) anodo condensatore preparato obiettivo proiettore schermo fluorescente Microscopio elettronico a trasmissione

11 Microscopia elettronica a trasmissione Prelievo Lavaggio in tampone fisiologico Taglio in frammenti molto piccoli (1mm diametro) Fissazione Glutaraldeide lavaggi in tampone Tetrossido di osmio (OsO4) Disidratazione Etanolo, simile alla microscopia ottica Inclusione Resine liquide che solidificano a 70 C Piccoli contenitori cilindrici

di griglia Colorazione Sali di metalli pesanti - URANIO - (acetato

12 Microscopia elettronica a trasmissione Sezionamento Ultramicrotomo - Lama di diamante - Sezioni ultrafini (50-70 nm) - Retini dotati di griglia Colorazione Sali di metalli pesanti - URANIO - (acetato di uranile) Lavaggi in acqua distillata PIOMBO (citrato di piombo)

13 Microscopia elettronica a trasmissione Microfotografia al microscopio elettronico di un linfocita B umano

14 Microscopia elettronica a trasmissione Mitocondrio

15 Microscopia elettronica a scansione MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE: gli elettroni accelerati attraversano la sezione del campione e raggiungono uno schermo fluorescente (immagine in bianco e nero, stuttura interna del campione) MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE: gli elettroni colpiscono il campione NON sezionato, che produce elettroni secondari, che raggiungono uno schermo, dove vengono integrati gli impulsi provenienti da tutte le direzioni (immagine in bianco e nero, struttura esterna tridimensionale del campione)

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16 Microscopia elettronica a scansione Microscopio elettronico a scansione Procedura - Prelievo - lavaggio - Fissazione - Essiccamento (essiccatore) - Metallizzazione (metallizzatore) (ricopertura con oro o argento) Il fascio elettronico urta il campione. Produzione di elettroni secondari raccolti da un sensore ed integrati in un monitor a formare l immagine tridimensionale della struttura esterna

17 Microscopia elettronica a scansione

nanometri) coniugate con anticorpi specifici per l antigene cercato Oro è

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