Leucocitoaferesi e malattie infiammatorie croniche intestinali: le premesse fisiopatologiche e biologiche

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1 Leucocitoaferesi e malattie infiammatorie croniche intestinali: le premesse fisiopatologiche e biologiche M. Vecchi Università degli Studi di Milano IRCCS Policlinico San Donato

2 L intestino non infiammato

3 L intestino non infiammato Sostanze e citochine proinfiammatorie Sostanze e citochine anti-infiammatorie

4 L intestino non infiammato

5 Danno Danno Intestino nelle malattie infiammatorie croniche intestinali Barriera intestinale debole Penetrazione del contenuto intestinale e dei batteri Difese immunitarie di barriera deboli Malattia Sostanze e citochine antiinfiammatorie Sostanze e citochine proinfiammatorie Assetto pro-infiammatorio del sistema immunitario Citochine proinfiammatorie Aumento dei fenomeni proinfiammatori Amplificazione della risposta immunitaria e cronicizzazione

6 Role of MAdCAM-1 and α4β7 in lymphocyte recruitment at intestinal level

7 Lymphocyte Recruitment Into Gut Mucosa α4β7 mediates selective migration of pathogenic gut-homing lymphocytes, resulting in excess inflammatory infiltrate in the GI tract Transmigration Capture Rolling Firm Adhesion

8 Leucocitoaferesi e IBD Leucocitoaferesi terapia non farmacologica, anti-infiammatoria e immunomodulante, volta alla rimozione dal circolo ematico di cellule responsabili dello stato infiammatorio nelle malattie infiammatorie croniche intestinali. Grazie alla Leucocitoaferesi, vengono rimossi dal sangue Leucociti, principalmente Granulociti Neutrofili e Monociti, e anche una parte di piastrine. Numerosi studi hanno indagato l efficacia della Leucocitoaferesi come terapia alternativa o adiuvante a quelle convenzionali farmacologiche nel trattamento delle IBD. Attualmente, viene applicata nel trattamento di pazienti affetti da IBD in fase attiva lieve/moderata, non rispondenti/intolleranti o nei quali sussistano controindicazioni a terapie convenzionali.

9 Leucocitoaferesi e IBD: il sistema LEUCAPHER e LA25 Tecnologia recente basata sull uso di un polimero sintetico come materiale sorbente. Adsorbimento: 45-55% GB 5-65% Neutrofili 75-8% Monociti 4-5% Piastrine 1-2% Linfociti - 1 seduta/settimana per 5 settimane consecutive; - 3 ml/min di sangue processato per 6 minuti di trattamento; Di Girolamo M et al. Therapeutic Apheresis and Dialysis 216 Dec;2(6):

10 LA25: cartuccia sorbente in Polisulfone Idrofilico PERCHÉ POLISULFONE IDROFILICO? Polimero Sintetico trattato con Polivinilpirrolidone Altamente Emo-Biocompatibile. Materiale noto in altri contesti clinici: l elevata biocompatibilità ha comportato la definizione di specifiche configurazioni del materiale per applicazioni soprattutto in nefrologia. WINCHESTER JF et al. Replacement of Renal Function by Dialysis. Springer 22. La configurazione basata su piccoli cilindri del materiale permette l adsorbimento di Granulociti Neutrofili, Monociti e Piastrine.

11 Piastrine e IBD Yoshida H, et al. Inflammatory Bowel Disease, 21

12 STUDIO BASELINE Biocompatibilità e Adsorbimento su sangue dell acetato di cellulosa e del polisulfone idrofilico Obiettivo Caratterizzare i meccanismi di azione del materiale: Attivazione: 1. del Sistema del Complemento 2. delle popolazioni cellulari target della terapia leucocitoaferetica perché coinvolte nella eziopatogenesi delle MICI. Le eventuali attivazioni di questi fattori target considerati, dovute al contatto sangue-materiale, possono limitare l effetto immunomodulante e anti-infiammatorio del materiale stesso. Nello studio il Polisulfone è stato posto a confronto con il materiale più affermato per le procedure leucocitoaferetiche.

13 PO OL In Vitro: Analisi del contatto materiali-sangue da donatore sano

14 % Cellule CD35 / CD88 POS. C3a (mg/ml) Attivazione del Complemento (Sangue da donatore) Attivazione del Complemento Frazione Cellulare Attivazione del Complemento Plasma C3a ,6 63, 38,3 59,6 6,7 44, ,16 3,34 3,5 3,15 3,69 2, NT AC PS NT AC PS NT AC PS NT AC PS 3 MIN. 1 H 3 MIN. 1 H Minore Attivazione del Complemento in seguito al contatto con il Polisulfone. Il trattamento con il Polisulfone comporta una MINORE ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO anche rispetto al NT. Nel Trattamento con il Polisulfone, il livelli di concentrazione di C3a rimangono uguali ai valori basali. Media di 3 esp. ± s.e.m.

15 % MONOCITI CD86 pos. TNFa (pg/ml) Monociti Frazione Cellulare (Sangue da donatore) Attivazione dei Monociti Frazione Cellulare 6,8 8,3 11, 13,6 12,3 7,2 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 Attivazione dei Monociti Plasma TNFa 2,3 2, 2,5 2,4 5 1,,5,5,5 NT AC PS NT AC PS, NT AC PS NT AC PS 3 MIN. 1 H 3 MIN 1 H Media di 3 esp. ± s.e.m. Il contatto con il Polisulfone «riporta» l attivazione ai livelli basali, dopo un ora di trattamento. In seguito al contatto con il polisulfone il grado di attivazione al termine del trattamento è inferiore anche rispetto al NT Marcata differenza di attivazione tra i due materiali in termini di TNFa.

16 % Granulociti MPO Pos. Granulociti: Frazione Cellulare (Sangue da donatore) 12 Attivazione dei Granulociti - Frazione Cellulare 1 92,6 92,8 96,6 94,6 95,9 93, NT AC PS NT AC PS 3 MIN 1 H Il contatto con i materiali non determina particolare attivazione granulocitaria. Media di 3 esp. ± s.e.m.

17 % Piastrine CD62p POS. % In Vitro: Attivazione Piastrinica - Frazione Cellulare (Sangue da donatore) Maggiore attivazione piastrinica con l acetato. A tempi diversi il contatto con il polisulfone riduce l attivazione Attivazione Piastrinica Frazione Cellulare 68,6 55,5 67,4 25,1 54,6 6,3 16,3 TO NT AC POLI NT AC POLI 3 MIN 1 H ,8 9,4 3 MIN 1 H -46,9-285, AC VS NT PS VS NT AC VS NT = (AC-NT)*1/AC PS VS NT = (PS-NT)*1/PS A tutte le tempistiche, nel trattamento con il Polisulfone, l attivazione è inferiore rispetto al NT. Media di 3 esp. ± s.e.m.

18 % Linfociti Int. b7 Pos. % Linfociti B CD25 Pos. % Linfociti T CD25 Pos. Il contatto con i materiali non attiva le popolazioni linfocitarie B o T Risultati confermati sulla frazione cellulare e sul plasma Citochine (IL-4, IFNg, Il-17, IL-1) non dosabili Attivazione Linfociti B - Frazione Cellulare 15,7 15,9 15,4 15,3 16,4 15,8 NT AC PS NT AC PS 3 MIN. 1H Attivazione Linfociti T - Frazione Cellulare ,5 35,6 34,3 35,8 35,9 3 24,1 2 1 NT AC PS NT AC PS 3 MIN. 1 H 45, 4, 35, 3, 25, 2, 15, 1, 5,, Attivazione Linfociti T - Fattori di Trascrizione 37,1 33,1 33, 2,1 1,6 1,5 NT AC PS FOXP3 T-BET Attivazione Linfociti con Homing Intestionale 71, 71,9 74,5 63,3 62,5 64,5 NT AC PS NT AC PS 3 MIN 1 H Media di 3 esp. ± s.e.m.

19 Prove EX VIVO Sono state condotte PROVE STATICHE di valutazione biocompatibilità in termini di attivazione del Sistema del Complemento e della componente leucocitariopiastrinica indotta dal contatto materiale-sangue utilizzando Sangue ricevuto da 2 pazienti affetti da malattie infiammatorie croniche intestinali in fase attiva, privi di terapia al momento del prelievo. SETTING E WORKFLOW SPERIMENTALE UGUALI A QUELLI DELLE PROVE IN VITRO

20 PO OL In Vitro: Analisi del contatto materiali-sangue da paziente

21 % Cellule CD35/CD88 Pos. Attivazione del Complemento: FRAZIONE CELLULARE (Sangue da pazienti) C3a (ug/ml) MINORE ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO NEL CONTATTO CON IL POLISULFONE EX VIVO Attivazione del Complemento - Frazione Cellulare 75,9 74,4 58,1 68,5 78, 64,7 5, 4, 3, 2,24 EX VIVO Attivazione del Complemento Plasma C3a 2,82 2,35 3,11 3,75 3,57 4 2, , NT AC PS NT AC PS 3 MIN 1H, NT AC PS NT AC PS 3 MIN 1H Nel trattamento con il Polisulfone, Livelli di attivazione sono inferiori rispetto all AC a diverse tempistiche di contatto.

22 % Monociti CD86 Pos. % Granulociti MPO Pos. ATTIVAZIONE DEI MONOCITI E DEI GRANULOCITI (Sangue da pazienti) IL CONTATTO CON I DUE MATERIALI NON DETERMINA L ATTIVAZIONE ,9 EX VIVO Attivazione Monocitaria Frazione Cellulare 5, 48,4 43,4 45,5 45, EX VIVO Attivazione dei Granulociti - Frazione Cellulare 82, 95,4 91,3 88,8 82,2 95, NT AC PS NT AC PS 3 MIN 1H NT AC PS NT AC PS 3 MIN 1H Sul plasma ASSENZA di dati perché citochine non rilevabili

23 % Piastrine CD62p Pos. ATTIVAZIONE PIASTRINICA (Sangue da pazienti) MINORE ATTIVAZIONE PIASTRINICA NEL TRATTAMENTO CON IL POLISULFONE, ANCHE RISPETTO AL NT % Attivazione Piastrinica rispetto al NT AC VS NT PS VS NT AC VS NT PS VS NT EX VIVO Attivazione Piastrinica Frazione Cellulare -5-8,1 3 MIN -4,9 1 H ,2 76,7 7,8 69, ,1-139, ,5 46, NT AC PS NT AC PS Livelli di Attivazione nel trattamento con il PS, più ridotti anche rispetto al NT 3 MIN 1H AC VS NT = (AC-NT)*1/AC PS VS NT = (PS-NT)*1/PS

24 RISULTATI STUDIO BASELINE Il POLISULFONE RISULTA PIÙ EMOCOMPATIBILE RISPETTO ALL ACETATO minore attivazione del sistema del complemento nel caso del contatto del sangue con il polisulfone, a tempistiche diverse, sia nella frazione cellulare che sul plasma. minore attivazione monocitaria (non confermato nei pazienti) nel caso del contatto sangue-polisulfone, presente nella frazione cellulare e confermata sul plasma. marcata riduzione dell attivazione piastrinica nel caso del trattamento con polisulfone. nessuna variazione dello stato di attivazione Linfocitaria e Granulocitaria per entrambi i materiali rispetto al NT.

25 Conclusioni e sviluppi futuri La Leucocitoaferesi è volta alla rimozione dal sangue periferico di specifici fattori implicati nella eziopatogenesi delle IBD e, perciò, può essere una terapia da applicare come adiuvante o sostitutiva a quelle farmacologiche. La Terapia Leucocitoaferetica basata sull utilizzo di Polisulfone come materiale adsorbente presenta alcune caratteristiche peculiari. Il materiale risulta essere emocompatibile. L elevata emocompatibilità ne potrebbe favorire gli effetti anti-infiammatori e immunomodulanti, rilevati nelle applicazioni cliniche. Necessità di approccio sistematico e scientifico della applicazione delle procedure leucocitoaferetiche: Definizione di Dose di terapia adeguata alle esigenze cliniche specifiche.

26 Grazie a.. UNIMI- IRCCS Policlinico San Donato, San Donato Milanese L. Pastorelli, G.E. Tontini Science and Technology Park for Medicine, Mirandola C Gemelli, A. Cuoghi

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