VMATGC, esercitazione pratica, Metodi di Trafezione cellulare, esercitazione pratica 2016 (Prof.ssa F. Ascenzioni)

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1 1 Metodi di Trafezione cellulare, esercitazione pratica 2016 (Prof.ssa F. Ascenzioni) La trasfezione di cellule di mammifero richiede l uso di agenti trasfettanti o di metodi fisici di permeabilizzazione temporanea della membrana cellulare, quali l elettroporazione. Utilizzando queste metodiche gli acidi nucleici (DNA o RNA) entrano nella cellula, raggiungono il nucleo e permettono l espressione del transgene. In questa esercitazione pratica saranno eseguite trasfezioni di cellule epiteliali HeLa (...) con il plasmide pmaxegfp utilizzando tre diverse metodiche: 1) complessi lipidici DNA/ESCORT IV; 2) complessi lipidici DNA/lipofectamina (detta anche lipofezione lipofection ); 3) elettroporazione. Tutte le metodiche saranno utilizzato con il plasmide pmax, rappresentato in Figura 1. Una rappresentazione schematica e generale dell intera procedura di trasfezione e dei delle diverse fasi temporali è riportata in figura S1. Figura 1, mappa del plasmide pmax Protocollo 1 Trasfezione di cellule HeLa con complessi di DNA/ESCORT IV ESCORT IV (SIGMA) è un complesso lipidico costituito da 1 lipide policationico ed un lipide neutro. La sua formulazione è protetta da brevetto. Il lipide policationico permette, per interazione elettrostatica, la formazione di liposomi contenenti gli acidi nucleici; il lipide neutro favorisce la fusione con le membrane cellulari e l internalizzazione del complesso. 1

2 2 Giorno -1 Il giorno precedente la trasfezione distribuire 8x10 4 cellule /pozzetto in 1 ml di terreno DMEM, 10% FBS, Glutamina, di una piastra per coltura da 24 pozzetti. Nella figura 2 è riportato lo schema della piastra A B A A CM1 C B B CM2 CL D Figura 2. Schema della piastra di trasfezione. Pozzetti A, condizione di trasfezione A; Pozzetti B, condizione di trasfezione B; Pozzetti CM1-2, condizione di trasfezione CM1 e CM2;. Pozzetto CL, cellule non trasfettate Giorno 0 Preparazione dei complessi Provetta 1: 1 µg pmax in 50 µl MEM Provetta 2: 2 o 4 µl di ESCORT IV in 50 µl di MEM Incubare 5 min a temperatura ambiente Unire il contenuto della provetta 1 alla provetta 2 ed incubare per 30 min a temp ambiente. In questa esercitazione vengono preparate le seguenti trasfezioni, A, 1 µg pmax, 2 µl ESCORT IV, in duplicato B, 1 µg pmax, 4 µl ESCORT IV, in duplicato CM1, senza DNA, 2 µl ESCORT IV CM2, senza DNA, 4 µl ESCORT IV Preparazione delle cellule Osservare le cellule al microscopio per accertarsi del buono stato delle stesse e dell assenza di possibili contaminanti (batteri e/o funghi). Aspirare il terreno, lavare 2 volte con MEM ed aggiungere 400 µl di MEM. Aggiungere 100 µl di complesso nei rispettivi pozzetti (il complesso va aggiunto lentamente, goccia a goccia e miscelato agitando lentamente la piastra). Nel pozzetto CL, aggiungere 100 ml di MEM. Incubare la piastra a 37 C nell incubatore a CO 2 per 6 ore. Aspirare il terreno con i complessi ed aggiungere 500 µl di terreno DMEM completo (DMEM, 10%FBS, Glutamina 2mM, Penicillina/Streptomicina 50U/ml). Incubare a 37 C ed esaminare l espressione del marcatore (GFP) e la vitalità delle cellule dopo 48 ore dalla trasfezione. 2

3 3 Protocollo 2 Trasfezione di cellule HeLa con lipofectamina La lipofectamina è una miscela di lipidi DOSPA e DOPE 3:1 (w/w) di cui uno policationico (DOSPA) e l altro neutro. La sua formulazione è protetta da brevetto. Il lipide policationico permette, per interazione elettrostatica la formazione di liposomi contenenti gli acidi nucleici; il lipide neutro favorisce la fusione con le membrane cellulari e l internalizzazione del complesso. Giorno -1 Il giorno precedente la trasfezione distribuire 8x10 4 cellule /pozzetto in 1 ml di terreno DMEM, 10% FBS, 2 mm Glutamina, di una piastra per coltura da 24 pozzetti. Nella figura 2 è riportato lo schema della piastra A B A A CM1 C B B CM2 CL D Figura 2. Schema della piastra di trasfezione. Pozzetti A, condizione di trasfezione A; Pozzetti B, condizione di trasfezione B; Pozzetti CM1,2, condizione di trasfezione CM1 e CM2;. Pozzetto CL, cellule non trasfettate Giorno 0 Preparazione dei complessi Provetta 1: 1 µg pmax in 50 µl Optimem Provetta 2: 2 o 4 µl di lipofectamina in 50 µl di Optimem Incubare 5 min a temperatura ambiente Unire il contenuto della provetta 1 alla provetta 2 ed incubare per 30 min a temp ambiente. In questa esercitazione vengono preparate le seguenti trasfezioni, A, 1 µg pmax, 2 µl lipofectamina, in duplicato B, 1 µg pmax, 4 µl lipofectamina, in duplicato CM1, senza DNA, 2 µl lipofectamina CM2, senza DNA, 4 µl lipofectamina Preparazione delle cellule Osservare le cellule al microscopio per accertarsi del buono stato delle stesse e dell assenza di possibili contaminanti (batteri e/o funghi). Aspirare il terreno, lavare 2 volte con MEM ed aggiungere 400 µl di Optimem. Aggiungere 100 µl di complesso nei rispettivi pozzetti (il complesso va aggiunto lentamente, goccia a goccia e miscelato agitando lentamente la piastra). Nel pozzetto CL, aggiungere 100 ml di Optimem. Incubare la piastra a 37 C nell incubatore a CO2 per 6 ore. Aspirare il terreno con i complessi ed aggiungere 500 µl di terreno completo (DMEM, 10%FBS, Glu 2mM, P/S 50U/ml). Incubare a 37 C ed esaminare l espressione del marcatore (GFP) e la vitalità delle cellule dopo 48 ore dalla trasfezione. 3

4 4 Protocollo 3 Elettroporazione di cellule HeLa L esposizione di cellule in sospensione ad una scarica elettrica accumulata sui due elettrodi di un condensatore, determina una depolarizzazione con migrazione delle cariche ioniche normalmente distribuite dentro e fuori della membrana cellulare. Ciò causa anche destabilizzazione delle membrane cellulari con formazione transiente di pori di dimensioni variabili. Questo consente alle molecole con carica elettrica presenti nella soluzione, ivi incluse le molecole di DNA transfettante, un attraversamento facilitato della membrana mediato dal campo elettrico generato dalla differenza di potenziale applicata agli elettrodi. I pori nella membrana aperti dalla scarica elettrica consentono invece un trasferimento diretto del DNA nel citoplasma. Le condizioni fisico-chimiche quali forza ionica della soluzione, quantità di carica elettrica, differenza di potenziale applicata agli elettrodi sono ottimizzati per avere il migliore compromesso tra efficienza di trasfezione e mortalità cellulare. Giorno 1 Staccare le cellule con tripsina: Aspirare il terreno, lavare 1 volta con PBS, aggiungere 1,5 ml di tripsina (0,53 mm), incubare a 37 C per 10 min. Aggiungere 3 ml di terreno completo, trasferire la sospensione cellulare in tubi da 15 ml, raccogliere le cellule mediante centrifugazione (1500 rpm per 5 min). Eliminare il sovranatante (SN), risospendere le cellule in 0,5 ml di PBS, preparare una diluizione 1/10 (50 µl di cellule µl di PBS) per contare con la camera contaglobuli. Infine aggiustare la densità cellulare a 5x10 6 cell/ml. Trasferire 100 µl della sospensione di cellule in una cuvetta sterile da elettroporazione 0,2 cm, preraffreddata, aggiungere 2 ul di DNA plasmidico pmax 0,5 µg/µl. Selezionare le condizioni di elettroporazione: 500 µf, 160 Volts. Posizionare la cuvetta nell apposito alloggio ed applicare l impulso. Prendere nota del valore time constant. Aggiungere 400 µl di terreno di coltura, raccogliere tutta la sospensione cellulare e traferire in 1 pozzetto della piastra da 24 pz. Aggiungere 0,5 ml di terreno. Incubare la piastra a 37 c per 48 ore. Analizzare l espressione del gene reporter GFP. In questa esercitazione allestiamo le seguenti elettroporazioni: A) HeLa 5 x 10 5 cellule, 1 µg pmax B) HeLa 5 x 10 5 cellule, senza DNA 4

5 5 Analisi dei risultati della trasfezione e brevi cenni di citofluorimetria Una prima verifica del lavoro svolto consiste nell assicurarsi che non vi sia contaminazione batterica e sia mantenuta una buona fisiologia delle cellule trasfettate e non (adesione alla superficie di crescita e morfologia propria). L espressione del gene reporter può essere seguita al microscopio a fluorescenza e/o mediante citofluorimetria. Microscopia a fluorescenza. Se si dispone di un microscopi a fluorescenza invertito, l osservazione può essere effettuata direttamente con le cellule adese nella piastra di coltura. La piastra viene posta sul tavolino del microscopio, l osservazione viene prima fatta in campo chiaro con l obiettivo 10X e/o 20X, poi si passa alla fluorescenza andando ad esaminare il campo precedentemente individuato in chiaro. In tal modo si può avere una visione panoramica dei vari pozzetti ed un dato qualitativo di espressione del gene reporter GFP. Fluorimetria Preparazione dei campioni Per l analisi al citofluorimetro è necessario staccare le cellule dalla piastra con tripsina. Aspirare il terreno, lavare 1 volta con PBS, aggiungere 100 µl di tripsina, incubare a 37 C per 10 min. Aggiungere 200 µl di terreno completo, trasferire la sospensione cellulare in tubi da 15 ml, raccogliere le cellule mediante centrifugazione (1500 rpm per 5 min). Eliminare il sovranatante (SN), risospendere le cellule in 1ml di PBS e contare le cellule con la camera contaglobuli. Prelevare 3 x 10 5 cellule, trasferire in eppendorf da 1,5 ml e centrifugare per 5 min a 2000 rpm. Togliere il SN, risospendere in 300 µl di PBS, aggiungere 1 ml di Ioduro di propidio (3,3 µg/ml). Trasferire le cellule in tubi per la lettura al FACS. Analisi al FACS La citofluorimetria permette di analizzare popolazioni cellulari, a livello di singola cellula, valutandone una serie di parametri utili, quali la vitalità cellulare (IP) e l espressione di particolari geni marcatori e/o reporter (GFP). Nei nostri esperimenti, l analisi al FACS ed i dati ottenuti sono utilizzati per determinare l efficienza di trasfezione e la tossicità dell agente trasfettante. La sospensione cellulare aspirata dallo strumento viene convogliata con un flusso regolabile attraverso un sottile capillare in cui avviene l analisi del numero, delle dimensioni e dei fluorocromi associati alle cellule in transito. Segnali multipli di fluorescenza possono essere generati da coloranti fluorescenti (IP) o geni reporter (GFP). L eccitazione con luce ad opportune λ consente pertanto un analisi qualitativa e quantitativa dell intensità di luce emessa da uno specifico fluoroforo (valore medio dell intensità di fluorescenza - MFI) e del numero di cellule che emettono la fluorescenza. Quindi, l intensità di uno specifico segnale di fluorescenza si correla con il grado di espressione di un determinato prodotto genico e numero di cellule positive ad esso, espresso in % o come numero assoluto. Esempi di analisi al FACS di cellule trasfettate con pmax sono riporati in Figura 3. 5

6 6 Figura 3. Box plot ed analisi di cellule trasfettate con il plasmide pmax. FL1H, GFP; FL3H, ioduro di propidio. Giorno -1 Giorno 0 Giorno 2 Preparazione cellule Trasfezione Analisi FACS Figura S1, rappresetntazione schematic della procedura di trasfezione. 6

7 7 Valutazione dei dati sperimentali Le condizioni sperimentali effettuate ed i dati ottenuti dall analisi al FACS permettono di: 1. Valutare la tossicità dell agente trasfettante. Questa si ottiene dalla frazione di cellule ioduro di propidio positive nei campioni mock ovvero trattati solo con l agente trasfettante. Questo dato può essere utile per selezionare la quantità di agente trasfettante meglio tollerata dalle cellule. Campioni di cellule mock sono sempre inclusi in esperimenti di trsfezione. 2. Valutare l efficienza di trasfezione. Questa viene comunemente espresso come % di cellule trasfettate, ovvero che esprimo il transgene. Eventualmente il valore può essere normalizzato in base alla quantità di DNA usata e quindi espresso come % di cellule trasfettate per µg di DNA trasfettante. Inoltre, è possibile valutare la tossicità dei complessi DNA/agente trasfettante andando a confrontare la frazione di cellule IP positive (cellule morte non trasfettate) con quella IP positive, GFP positive (cellule trasfettate ma morte). Se la frazione di cellele IP+ è paragonabile a quella ottenuta nei campioni mock, possiamo concludere che il complesso DNA/agente trasfettante non è più tossico dell agente trasfettante da solo. Alternativamente, se le cellule IP+, nei compioni trasfettati con i complessi conteneti DNA, sono maggiori di quelle dei campioni mock, si può ipotizzare una maggiore tossicità dovuta alla presenza di DNA. Complessivamente I risultati ottenuti dale diverse condizioni di trasfezione e dall analisi al FACS permettono di ottimizzare il protocollo di trasfezione per I vaeri tipi cellulari ed agente trasfettante. 7