Prof. Maria Nicola GADALETA

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1 Prof. Maria Nicola GADALETA Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Biotecnologie Biochimiche DISPENSA N. 10 MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA: STRUTTURA TERZIARIA E QUATERNARIA TRANSIZIONE T R T R DI Hb COOPERATIVITA

2 Confronto fra le strutture secondaria e terziaria di Mb e Hb 1. La Mb e le Hb di molte specie diverse hanno strutture secondarie simili: - ~ 70% α - elica - ~ stessa lunghezza dei segmenti di α - elica (nella subunità α manca D) - ~ stessi angoli delle curvature 2. Le catene α e β dell Hb hanno strutture terziarie pressochè identiche e molto simili alla struttura terziaria della mioglobina. L AVVOLGIMENTO GLOBINICO viene schematicamente descritto come il succedersi di 8 cilindri di α - eliche (A H) raccordati da segmenti di catena denominati AB, BC etc. + segmenti NA e HC (vedi fig. 7.6) STRUTTURA GLOBINICA: struttura comune delle Hb e Mb dei vertebrati stessa funzione fisiologica: è la più adatta a creare all EME l ambiente idoneo per legare reversibilmente O 2.

3 Confronto tra la struttura terziaria di Mb e di una subunità Hb da: Nelson & Cox Sequenze molto diverse possono specificare strutture molto simili

4 RAPPORTO GLOBINA:EME In H 2 O, l eme isolato è in grado di legare l O 2 solo per un attimo, poiché l Eme ferroso si ossida molto rapidamente a EME ferrico con la formazione di un intermedio EME-O 2 - EME. In Mb e Hb la His distale e altri residui intorno all EME impediscono la formazione di questo intermedio. IL SITO NON POLARE CHE LEGA L EME, ESCLUDENDO L H 2 O DALL AMBIENTE, PROTEGGE LO STATO FERROSO DELL EME DALL OSSIDAZIONE (è molto più difficile strappare un e - al Fe 2+ ). La FUNZIONE DELLA GLOBINA non è tanto quella di fare da supporto all Eme, quanto fornire al ferro un microambiente idrofobico essenziale per lo scambio di O 2.

5 RUOLO DELL APOPROTEINA L AVVOLGIMENTO GLOBINICO è l avvolgimento nello spazio di una catena polipeptidica che porta alla formazione di una cavità idrofobica per l EME: porta 60 e più atomi di residui apolari della proteina a contatto con l Eme. In generale: La funzione di un gruppo prostetico dipende in parte dall ambiente proteico che lo circonda. Es. eme trasporta elettroni invece di O2 in cit.c e catalasi.

6 da: Nelson & Cox

7 EME in Mb e Hb = PROTOPORFIRINA IX + Fe +2 (parte organica) (parte inorganica) PROTOPORFIRINA: 4 gruppi pirrolici uniti da ponti metinici, anello tetrapirrolico planare PROTOPORFIRINA IX Sostituenti: 4 METILI 2 VINILI 2 PROPIONATI Fe-protoporfirina IX

8 Il Fe +2 forma 4 legami di coordinazione con i 4 N della protoporfirina (sul piano dell EME) Il Fe +2 può formare altri 2 legami (5 a e 6 a posizione di coordinazione) in direzioni opposte tra loro e perpendicolari al piano dell EME. 5 N N N N 6

9 da: Nelson & Cox (prossimale, F8) -Il Fe+2 si lega ad una delle istidine con la 5a posizione di coordinazione His F8 o His PROSSIMALE -il sito che lega l O 2 si trova sul piano dell EME dal lato opposto di F8 ed è la 6 a posizione di coordinazione del Fe +2

10 -Fe+2 (Ferroso) Ferromioglobina -Fe+3 (Ferrico) Ferrimioglobina (o metamioglobina) Solo la prima forma è capace di legare in forma reversibile O2 Un secondo residuo di istidina HIS E7 - HIS DISTALE si trova nelle vicinanze ma non è legato al gruppoeme (legame H con l O2).Vedi fig.7.5

11 da: Nelson & Cox

12 Il gruppo EME è situato nella tasca idrofobica della mioglobina Le catene laterali di propionato puntano verso la superficie della molecola : a ph fisiologico sono ionizzate -Il resto dell EME è dentro la tasca circondato da residui non polari:fanno eccezione le 2 istidine F8 ed E7 -Il Fe+2 nella deossimioglobina è spostato di circa 0.3 Å fuori dal piano dell EME verso l His prossimale Lo stesso vale per la Emoglobina

13 Basi strutturali della diminuita affinità di Mb e Hb per CO

14 Mb ed Hb legano CO: molto importante dal punto di vista biologico perché il metabolismo dell EME libera CO 1% dei siti Hb e Mb occupati da CO tollerabile se Hb e Mb affinità EME = per CO libero intollerabile EME libero e in soluzione lega CO > di O 2 Mb e Hb affinità per CO 200 > O 2 E stato dimostrato attraverso: RX su cristalli Spettroscopia dell IR dei complessi CO e O 2 con Mb Modelli sintetici che la diminuita affinità di Mb e Hb per CO sta nella diversa geometria degli angoli Fe-CO nell EME libero e nella CO-Hb o CO Mb CO = veleno = blocca trasporto di O 2 : diminuisce siti disponibili a legare O 2 fumo = occupazione di molti siti di Hb da CO: respirazione alterata

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16 Mb e Hb legano CO da: Campbell & Farrell (a) Eme libero con imidazolo (b) Complesso Mb:CO (c) Ossimioglobina Figura 4.17 L ossigeno e il monossido di carbonio legati al gruppo EME della mioglobina. La presenza dell istidina E7 forza l ossigeno o il CO a formare un legame con un angolo di 120

17 CONFORMAZIONI DELLA EMOGLOBINA

18 E stata postulata e poi dimostrata l esistenza di due strutture quaternarie per l Hb - una forma con legami più numerosi e più forti, con minore affinità per O2 Forma T (tesa) - una forma con legami più scarsi o più deboli, con maggiore affinità per O2 Forma R (rilassata) e la transizione T R in seguito a ossigenazione. da: Nelson & Cox O2

19 Legami salini che irrigidiscono e rendono più compatta la forma T 8 legami - 4 coinvolgono i gruppi COO - terminali - 2 intercatena - 2 intracatena Figura 7.9 (b)

20 Altri legami che rendono compatta la forma T da: Styer L. DPG abbassa l affinità per O 2 perché crea legami addizionali tra le subunità stabilizzando la struttura quaternaria della deossiemoglobina (forma T).

21 - il DPG si lega 1:1 con deossi Hb - Il DPG si lega nella cavità centrale di deossi Hb - residui carichi + di entrambe le catene β di deossi Hb interagiscono con le cariche del DPG (5 a ph fisiologico) da: Voet & Voet (II Ed.)

22 Transizione strutturale T R in seguito ad ossigenazione La transizione T R si ha per: a) rottura dei legami ionici che stabilizzano lo stato T della deossi Hb b) espulsione di DPG dalla cavità di deossi Hb che si restringe: diminuisce la distanza tra le eliche H delle catene β ed aumenta la distanza dei gruppi terminali NH3+ che non possono più rimanere in contatto col DPG: quindi perdita dei legami che contribuivano a rendere compatta la forma T.

23 Transizione strutturale T R in seguito ad ossigenazione da: Nelson & Cox O2

24 1) I cristalli di Hb si rompono quando l Hb viene ossigenata struttura # 2) Diverso spettro O.D. emoglobina ossi e deossi 3) Studio ai RX # struttura 4 a OSSIGENAZIONE DI Hb i due EME β si avvicinano ( Å) Ossigenazione i due EME α si allontanano la cavità centrale si restringe Da: Stryer L. La HB si comporta come un dimero α β

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26 VARIAZIONI DELLA STRUTTURA QUATERNARIA E NUOVI CONTATTI TRA LE SUBUNITA IN SEGUITO A OSSIGENAZIONE Esistono 6 superfici di contatto tra le 4 catene (legami H) OSSIGENAZIONE La forma a coda di rondine della superficie α 1 β 2 di contatto, mette in grado le due subunità di scivolare facilmente l una sull altra: si rompono alcuni legami deboli, altri se ne formano.

27 Perché la struttura terziaria di una subunità di Hb cambia in seguito al legame con O 2? Il cambiamento è indotto dall entrata del Fe +2 nel piano dell EME Da: Stryer L.

28 Perché il Fe +2 entra nel piano dell EME dopo ossigenazione? a) motivo elettronico b) motivo sterico: raggio ionico del Fe +2 diminuisce del 13% DeoxiHb legame di coordinazione col Fe +2 : prevalentemente ionico 4 elettroni del Fe +2 spaiati: paramagnetica Fe +2 troppo voluminoso: non entra nel piano dell EME: spostato verso His F8 OxiHb legame di coordinazione col Fe +2 : prevalentemente covalente i 4 elettroni del Fe +2 vengono spinti ad occupare due soli orbitali 3d i 6 orbitali esterni ricevono doppietti elettronici dai 5 N e dall O 2 : diamagnetica Fe +2 entra nel piano dell EME

29 Perché il Fe +2 entra nel piano dell EME?

30 EFFETTO COOPERATIVO I punti di contatto α 1 β 2 e α 2 β 1 sono in stretta connessione con i gruppi EME. E, quindi, prevedibile che cambiamenti strutturali influenzino i gruppi EME e viceversa: effetto positivo del legame della prima molecola di O 2 sul legame delle altre molecole di O 2 al tetramero = interazione EME- EME: EFFETTO COOPERATIVO,. EFFETTO COOPERATIVO: un fenomeno che avviene in un punto della molecola (gruppo EME che lega O 2 ) viene risentito in altre parti della molecola fino a portare a variazioni della struttura quaternaria.

31 SPIEGAZIONE DELL EFFETTO COOPERATIVO: La deossiemoglobina è una molecola rigida per gli otto legami salini e per DPG. L ossigenazione non può aver luogo se alcuni di questi legami salini non vengono spezzati per permettere al Fe +2 di spostarsi verso il piano dell EME. Per permettere il legame del primo O 2 devono essere spezzati più legami salini rispetto ai successivi O 2, occorre cioè più energia. I legami salini si rompono progressivamente con l aggiunta di O 2 o risultano indeboliti. Il cambiamento della struttura quaternaria fa restringere la cavità centrale di Hb che non può più alloggiare DPG che viene espulso (altri legami ionici si rompono favorendo la struttura R).

32 La transizione T R diventa più probabile ad ogni successivo O 2 che si lega. La prima molecola di O 2 si lega a T, l ultima a R: l affinità di O 2 per la forma T ed R è, rispettivamente, di 1:300. Da: Strayer L.

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