Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie

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1 LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie Lucia Martelli influenza la terapia che è in funzione di permette di individuare cluster epidemici Presenza di patogeni piu frequentemente isolati oppure di patogeni non comuni Presenza di patogeni che mostrano antibiotico resistenza Presenza di patogeni per i quali le linee guida non prevedono un trattamento ottimale permette di individuare patologie causate da patogeni non endemici in quell'area Perchè una corretta diagnosi eziologica è importante? per studiare l andamento dell antibiotico resistenza Per aumentare l accuratezza delle raccomandazioni delle linee guida Per guidare i comportamenti in caso di patologie particolari come SARS, Influenza,Legionellosi patologie da bioterrorismo La diagnosi microbiologica rende possibile una: Diagnosi probabile quadro clinico compatibile Diagnosi definita + rilevazione di un patogeno polmonare in quantità medio alta (in modo semiquantitativo) quadro clinico tipico + agente eziologico probabile un campione non contaminato + probabile patogeno che non colonizza le vie respiratorie superiori La diagnosi microbiologica malattia E importante ma non sempre efficace gravità della È limitato Fattori interferenti con la diagnosi microbiologica - Adeguatezza del campione( assenza di contaminazione da parte della flora del tratto respiratorio superiore) nelle cap che necessitano di ricovero per pazienti ospedalizzati per pazienti immunocompromessi con infezioni delle basse vie nelle bronchiti nelle cap non complicate e in assenza di fattori di rischio (sono sufficienti le linee guida) - Uso di test diagnostici importanti sono: rapidi e sensibili esame microscopico la ricerca di antigeni tests di biologia molecolare 1

2 età Neonati(0-1 mo) lattanti (1-6 mo) Correlazione tra agenti patogeni ed età bambini (6 mo-5 yr) ragazzi (5-15 yr) giovani adulti(16-30) adulti microrganismi più probabili Escherichia coli, Streptococcus agalactiae Chlamydia trachomatis, RSV RSV, Parainfluenza Viruses Mycoplasma pneumoniae, Influenza Virus Tipo A Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Correlazione tra agenti patogeni e patologia Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari Acquisita in comunità S. pneumoniae, H. influenzae, Staphylococcus K. pneumoniae M.catarrhalis N. meningitidis Primaria atipica Mycoplasma pneumoniae Adenovirus, tosse non produttiva RSV, Clamydia spp. Influenza, Legionella spp., tuberculosis, polmoniti fungine acute Polmonite nosocomiale bacilli Gram neg(enterobacter, legionella Klebsiella, Acinetobacter S. pneumoniae, Pseudomonas), S. aureus, batteri anaerobi Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari polmonite ematogena Staphylococcus spp., Streptococcus spp. bacilli Gram negativi polmonite in paz. batteri come nella CAP* Legionella,Listeria immunodepressi Pneumocystis carinii, Histoplasma, Cytomegalovirus, Coccidioides HSV, Nocardia sp. Polmonite da aspirazione Funghi opportunisti * Candida * Mucor * Aspergillus anaerobi Staphylococcus, Bacilli Gram negativi aerobi Diagnosi Microbiologica Materiale Idoneo Escreato Escreato indotto Bronco Aspirato Lavaggio Bronchiale Lavaggio Broncoalveolare Liquido pleurico Germi comuni, Legionella Micobatteri Nocardia, miceti + P.carinii Idem Solo per Micobatteri, Legionella, P.carinii e miceti filamentosi Idoneo per tutte le ricerche batteriologiche,virologiche fungine parassitologiche Germi comuni,miceti,anaerobi Micobatteri,Legionella,Nacardia Diagnosi Microbiologica Materiale Idoneo Sangue Urina Siero Batteri Gram+,Gram- Miceti Rilevazione antigeni di Legionella, Pneumococco Per ricerche di anticorpi ricerca di antigene di Aspergillus La diagnosi Microbiologica es batteroscopico su materiali es colturale respiratori emocoltura rilevazione di antigeni Metodi di amplificazione genica tecnologie microarray Metodi indiretti tests sierologici 2

3 Esame microscopico Permette di Stabilire l'idoneità del materiale Valutare la quantità di PMN e microrganismi (processo infiammatorio e infezione batterica) Fare una diagnosi presuntiva mediante il rilevamento di potenziali patogeni può indurre ad attuare iter diagnostici diversi da quelli routinari Inoltre di avviare una terapia empirica verso patogeni meno comuni e di abbandonare terapie inappropriate Di validare i risultati dell'esame colturale Di valutare l'azione inibente della terapia antibiotica su microrganismi presenti che non si sviluppano in coltura Esame microscopico Materiale Biologico Idoneo Esame Colturale Isolamento batteri e miceti non esigenti dei materiali ottenuti con procedimenti non invasivi spesso non è specifico nè sensibile P e r l'eventuale precedente terapia antibiotica l'eventuale scarsa idoneità del campione difficoltà di interpretazione la presenza di flora delle alte vie che può includere eventuali patogeni (falsi positivi) o coprire il vero patogeno (falsi negativi) di materiali ottenuti con procedimenti invasivi permette Semina su terreni idonei Incubazione a 37 per 24-48h In atmosfera normale o in Co2 di attribuire un significato eziologico ai vari isolati se accompagnati da una valutazione numerica ANTIBIOGRAMMA (se previsto) LETTURA IDENTIFICAZIONE 3

4 Emocoltura E' raccomandata per tutti i pazienti con grave polmonite e se positiva permette di fare diagnosi Si ha positività nel 5-14% Rilevazione antigeni su materiali respiratori si basano su Agglutinazione al lattice Immunofluorescenza diretta EIA Il più comune isolato è S.pneumoniae Ricerca antigeni su materiali respiratori Sono rapidi Idonei per Virus influenzali A e B RSV Adenovirus Virus parainfluenza 1,2,3 HCMV HSV1,HSV2 Legionella, Pneumococco Rivelazione antigeni su urine Tests immunocromatografici S. pneumoniae e legionella pneumophila sier 1 Rapidi semplici Positivi anche dopo l'inizio della terapia S.pneumoniae Antigene (polisaccaride parete) Specificità >90% < nei bambini portatori sani Sensibilità 50-80% Svantaggi Cross-reattività con S.oralis e S.mitis Non distingue infezione in atto da infezione pregressa Il valore diagnostico è maggiore se associato a emocultura Antigene urinario di legionella Il test non rileva tutti i sierotipi Positività prolungata nel tempo Sensibilità % Specificità 100% Svantaggi 4

5 Diagnostica molecolare Si basa Ricerca del DNA mediante amplificazione con metodica PCR Tecnologia microarray Diagnostica molecolare identifica un organismo in base a sequenze geniche specifiche ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO AMPLIFICAZIONE CON PRIMER IDONEI A LIMITARE LA SEQUENZA GENICO SPECIFICA IDENTIFICAZIONE DNA AMPLIFICATO IMMUNO CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA SU GEL DI AGAROSIO FLUORESCENZA (REALTIME) Diagnostica molecolare Elevata sensibilità Elevata specificità Non necessita di isolamento batterico Non necessit di microrganismi vitali Può essere eseguita su materiale preventivamente congelato Determinazione qualitativa in Pcr tipo nested Determinazione quantitativa (virus erpetici latenti) Diagnostica Molecolare Svantaggi Costo elevato Se qualitativa non indica se infezione in atto o pregressa Non consente di procedere alla determinazione della sensibilità ai chemioterapici Richiede esperienza di metodiche molecolari Diagnostica Molecolare Nel nostro laboratorio vengono rilevati con PCR Virus respiratori Adenovirus VRS Influenza A-B HSV1-2 HCMV Batteri atipici Mycoplasma Legionella Chlamydia Microarray Rappresenta un potenziale interessante per il laboratorio di microbiologia Un DNA microarray (o DNA chip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida. Permette di Esaminare il profilo di espressione di un gene Di identificare un gene in una miscela di migliaia Sfrutta la tecnica di ibridazione inversa Miceti Aspergillo 5

6 Microarray Rapido (non necessita di reazioni di amplificazione) E' un sistema miniaturizzato Dotato di alta processività Permette analisi parallele su larga scala Nei laboratori di ricerca è stato utilizzato per 1. Identificare funghi patogeni coinvolti nelle micosi invasive 2. Identificazioni batteriche 3. Per una rapida identificazione da bottiglie di emocolture positive Metodi indiretti Metodi sierologici Tests di immunofluorescenza Tests di FC Non sono utili per una diagnosi precoce Sono importanti a scopi epidemilogici Utili per la diagnosi di infezione dei patogeni atipici Necessitano di due campioni uno in fase acuta ed uno in fase di convalescenza (sieroconversione) Permette di valutare se infezione in atto o infezione pregressa Polmonite da C.pneumoniae La C.pneumoniae è responsabile del5%- 15% delle polmoniti Diagnostica di alcune patologie Raramente è necessario il ricovero (anziani con comorbidità, associata ad altri patogeni) La reinfezione è comune Polmonite da C.pneumoniae Diagnosi microbiologica difficile La chlamydia è difficilmente coltivabile La sierologia è problematica e non specifica Nelle infezioni primarie le IgM possono impiegare anche 3 settimane a manifestarsi Le IgG 8 settimane: la negatività non esclude la malattia Nelle reinfezione leigm rimangono costanti Le IgG salgono rapidamente PCR con marchio CE e IVD Recentemente è uscita Real time PCR solo qualitativa Viene eseguita su materiale respiratorio É specifica per la specie Polmonite da M.pneumoniae Il Mycoplasma è responsabile del10%-20% delle polmoniti nei giovani adulti Diagnosi (troppo lento) Tests sierologici Le agglut a freddo >1.64 supportano la diagnosi ma sono poco specifiche La reazione di FC rileva le IgM se il prelievo è precoce PCR con marchio CE e IVD 6

7 Legionellosi Diagnosi di laboratorio metodiche utilizzate: - esame colturale * - rilevazione dell antigene urinario - test di immunofluorescenza diretta * - rilevazione di anticorpi -ibridizzazione degli acidi nucleici * *E IMPOTANTE L IDONEITA DEL MATERIALE Rappresenta il gold standard per la diagnosi (per un risultato positivo occorrono da 3 a 5 giorni ) Materiali idonei sputo * campioni broncoscopici.terreni idonei BCYE (buffered charcoal yeast extract) BCYE con antibiotico Fattori che influnzano la sensibilità E importante per Scarsa sopravvivenza nelle secrezioni Produzione scarsa di secrezioni Confermare i risultati positivi dell antigenemia Individuare infezioni sostenute da specie e sierogruppi diversi da sier 1 Identificazione Vengono valutate le seguenti caratteristiche Ricerca dell antigene urinario un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1 giorno dopo l insorgenza dei sintomi, può permanere per mesi ) L atg è un componente della frazione polisaccaridicadella parete Capacità di crescita su BCYE Morfologia tipica delle colonie Capacità di reagire con antisieri specifici fluorescenti e non Test di ibridizzazione del DNA RIA Metodiche EIA ( per più sierogruppi ) Immunocromatografiche (solo per legionella p. sier 1 ) E un esame ritenuto sufficiente a fornire un criterio microbiologico di certezza nelle definizione di caso 7

8 Antigene urinario Data la sua possibile permanenza protratta nelle urine può risultare difficile la distinzione tra infezione acuta fase di convalescenza infezione pregressa Antigene urinario Test immunocromatografico ( BIOTEST ) Sensibilità % ( dopo centrifugazione aumenta ) Specificità 100 % semplicità rapidità Svantaggi rileva solo la presenza di Lp 1 Immunofluorescenza diretta Questa tecnica che utilizza anticorpi fluorescenti specifici messi a contatto con frammenti di tessuto polmonare o secrezioni respiratorie pemette di di rilevare le presenza di legionelle nei materiali respiratori di identificare eventuali colonie sviluppatesi su terreni selettivi per legionella Immunofluorescenza diretta Permette di evidenziare le legionelle anche dopo alcuni giorni dall inizio della terapia antibiotica E possibile identificare L.pneumophila (sensibilità da 25 a 75% specificità sup a 95%) L. non pneumophila (specificità e sensibilità di questi reagenti non è stata ancora ben valutata) Diagnosi sierologica La rilevazione di anticorpi specifici (IgG, IgM IgA ) può essere fatta con varie metodiche Immunofluorescenza indiretta Metodi immunoenzimatici Metodi di microagglutinazione E utile per una diagnosi retrospettiva ( E significativo un aumento del titolo di almeno 4 volte) PCR Produce : Diagnosi rapida Rileva la presenza di varie specie e sierogruppi di legionella E applicabile a campioni ambientali Ha una sensibilità simile all esame colturale 8

9 Sindrome polmonare da hantavirus Malattia sistemica frequentemente letale Sierologica PCR Diagnosi Rilevazione IgM specifiche IgG specifiche in aumento Rilevazione RNA specifico nei capioni cinici Polmonite da P.carinii In pazienti con deficit dell'immunità cellulo-mediata diagnosi immunofluorescenza diretta sul BAL PCR Aspergillosi polmonare Diagnosi es. microscopico diretto non specifico Rilevazione del galattomannano su siero -La positività può precedere di 5-8 gg i sintomi clinici -Il test dovrebbe essere usato come screening -La rilevazione di risultati positivi in due campioni successivi supporta la diagnosi -Può essere usato come follow up della risposta clinica alla terapia -Il titolo diminuisce in caso di risposta clinica eccetto che per i paz. In terapia con echinocandine PGR Sensibilita 80% Specificità 89,2% 9