Dove, Come e Quando cercare la Legionella Diagnostica di laboratorio

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1 Convegno 20 gennaio 2006 ASL 4 Chiavarese Dove, Come e Quando cercare la Legionella Diagnostica di laboratorio Claudio Grillo, U.O. Laboratori e Reti di Monitoraggio Dipartimento ARPAL della Spezia

2 Sommario Il Laboratorio ARPAL I Laboratori di riferimento Caratteristiche generali Le matrici ambientali Siti di campionamento Tecniche di campionamento Analisi microbiologica Riferimenti utili 2

3 Legionella: il Laboratorio ARPAL Arpal,, Agenzia Regionale per la Protezione dell Ambiente Ligure, è organizzata in una Struttura Centrale e in quattro Dipartimenti Provinciali. Le competenze sono ambientali,, alle dipendenze funzionali delle Province, e sanitarie come organo tecnico di supporto alle ASL nelle attività analitiche di prevenzione collettiva. I Dipartimenti Provinciali sono articolati in tre Strutture Complesse, di cui una è l U.O. Laboratori e Reti di Monitoraggio. I laboratori ARPAL sono tutti riconosciuti dall ISS Organismo di Riconoscimento dei Laboratori conformi alla norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025,, e sono sempre più indirizzati ad un sistema di rete laboratoristica integrata. Il Laboratorio della Spezia effettua l analisi microbiologica di Legionella su campioni ambientali dai primi anni 90 e partecipa dal 1996 (saltuariamente) e dal 2000 con continuità ad un qualificato circuito interlaboratori a livello europeo per la qualità del dato. 3

4 Legionella: i Laboratori di riferimento I Laboratori che possono effettuare la ricerca di Legionella devono possedere requisiti minimi che li distinguono in laboratori ri di base,, di riferimento regionale e di riferimento nazionale (Lab. di Batteriologia e Micologia Medica dell ISS). La Regione Liguria ha individuato, con delibera n. 326 del , nel Dipartimento di Scienze della Salute dell Università di Genova il Laboratorio di riferimento Regionale per la sorveglianza e il controllo della Legionellosi in Liguria (Laboratori di Epidemiologia e Prevenzione delle malattie Infettive - Reparto Batteriologia). Il laboratorio di base ARPAL collabora con il L. R.R.. inviando i ceppi isolati nell ambiente, ma anche in un contesto di controllo di qualità del dato con verifiche reciproche sulle conferme dei ceppi isolati. 4

5 Legionella: caratteristiche generali Le legionelle sono microrganismi asporigeni, gram negativi, aerobi obbligati, non fermentanti gli zuccheri, generalmente di forma bastoncellare che possono presentare pleiomorfismo con forme coccoidi o filamentose (soprattutto in coltura), di dimensioni variabili da 0,3 a 0,9 µm m di diametro e µm di lunghezza, mobili per la presenza di uno o più flagelli polari o laterali. Presentano positività alla catalasi, saltuaria all ossidasi, produzione di beta-lattamasi nella maggioranza delle specie e, in alcune, autofluorescenza (es. L. bozemanii e L. gormanii 5

6 Legionella: caratteristiche generali Il genere Legionella è rappresentato attualmente da 48 specie che comprendono 70 sierogruppi. Legionella pneumophila, è costituita da 15 sierogruppi e, con il SG 1, è quella predominante in patologia umana. Tra Legionella species da segnalare L. micdadei anch essa spesso coinvolta in casi clinici e isolata da matrici ambientali. Gli aminoacidi,, in particolare la cisteina,, ne costituiscono la fonte energetica principale così come i composti del ferro ne stimolano la crescita, insieme ad altri elementi in tracce ( Cu, Mg, Mn ) 6

7 Legionella: caratteristiche generali La ISO 11731:1998 al punto 3.1 definisce Legionella come microrganismo Gram- negativo normalmente capace di crescere in non meno di due giorni su agar tamponato contenente carbone, estratto di lievito, L-cisteina e ferro,, formando colonie in genere bianche o grigie,, ma anche con colorazioni molto variabili che vanno dal viola al blu, al verde cedro. La stessa ISO richiama inoltre la presenza di un caratteristico aspetto a ground-glass glass (vetro smerigliato) delle colonie osservate allo stereomicroscopio con luce incidente, laterale, a bassa intensità. Queste condizioni, unitamente all assenza di crescita in terreno di coltura privo di L-L cisteina,, sono sufficienti per l identificazione presuntiva di Legionella. 7

8 Legionella: l ambiente naturale Legionella è un microrganismo ubiquitario,, ampiamente diffuso nell ambiente naturale dove l acqua ne rappresenta il serbatoio principale; è stata isolata da acque superficiali come laghi e corsi d acqua, da falde idriche, sorgenti termali, e, in generale, e, da ambienti umidi in presenza di larghi intervalli di ph (5,4 8,1) e di temperatura (25-50 C) 50 C). E stata inoltre isolata da fanghi e suolo: : in particolare sono segnalati isolamenti in occasione di ristrutturazioni edilizie (demolizione di un bagno) e di movimentazioni di terreno, sempre associati ad ambiente umido. In presenza di protozoi (amebe e ciliati), di alghe verdi e di biofilm batterico, Legionella mostra capacità di parassitismo utilizzando gli ospiti anche come mezzo di diffusione e protezione da agenti esterni. 8

9 Legionella: l ambiente artificiale Dal serbatoio naturale può passare in un ambiente artificiale, in genere in concentrazioni molto basse, per poi moltiplicarsi e raggiungere concentrazioni anche molto elevate in presenza di condizioni che ne favoriscano lo sviluppo Gli ambienti artificiali sono rappresentati dai sistemi di distribuzione idrica di grandi e medie dimensioni, (ospedali, alberghi, comunità, stabilimenti termali, piscine) ma anche di piccoli impianti (abitazioni, spogliatoi impianti sportivi); da impianti di condizionamento dell aria (torri di raffreddamento, umidificatori, filtri, acqua di condensa); da piscine, fontane, fontanelle ornamentali, idromassaggi e da qualsiasi apparato in grado di produrre aerosol. 9

10 Legionella: l ambiente artificiale Le condizioni che ne favoriscono lo sviluppo nell ambiente antropico sono rappresentate principalmente da: alcune caratteristiche dell acqua come, ed è certamente la più importante, una temperatura compresa tra i 25 e i 45 C, la presenza di sostanze biodegradabili che favoriscano formazione di biofilm,, la presenza di elementi in tracce (ferro in particolare), nonché la presenza di alghe e/o protozoi. Alcune caratteristiche dell impianto idrico come situazioni di ristagno dovuto ai rami morti o scarsa circolazione, presenza di incrostazioni e depositi calcarei nelle tubazioni e nei punti terminali, presenza di serbatoi di accumulo con scarsa manutenzione e poco ricircolo. 10

11 Legionella: dove campionare Nel corso degli ultimi quindici anni il nostro laboratorio ha isolato Legionelle dai siti più diversi : alberghi, ospedali, case di riposo, case vacanza, campeggi, navi, piccoli impianti sportivi, beauty- farm, sia dai punti terminali della rete di distribuzione dell acqua calda e fredda (in particolare docce), sia da serbatoi d accumulo, sia da incrostazioni e biofilm presenti nei bulbi e nei rompigetto. In ambiente ospedaliero è stata isolata anche da siti particolarmente a rischio come apparecchiature di respirazione assistita (umidificatori( umidificatori-gorgogliatori per l ossigeno terapia) 11

12 Legionella: cosa campionare Acqua del circuito d acqua calda,, ed eventualmente anche della fredda quando la temperatura è superiore ai 20 C (valutare situazioni con tubazioni calde-fredde che si sviluppano appaiate). Incrostazioni e biofilm da tubazioni, serbatoi, rompigetto dei rubinetti, bulbi doccia, rubinetti, doccette con tubi flessibili pendenti. Depositi da serbatoi d accumulo Piscine (vasche e spogliatoi) Acqua di condensa e filtri in impianti di condizionamento 12

13 Legionella: come campionare Tutti i campionamenti devono essere condotti in condizioni di sicurezza per gli Operatori che dovranno utilizzare i Dispositivi di Protezione Individuali previsti nel documento di valutazione del rischio (guanti, maschere filtranti, occhiali protettivi). ACQUA: utilizzare bottiglie sterili con capacità minima 1 litro, in polietilene (monouso) o in vetro ( autoclave per 15 a 120 C) contenenti una percentuale di tiosolfato di sodio dello 0,01% (1 ml/litro di una soluzione al 10%); utilizzare bottiglie incartate esternamente per prelievi ad immersione (es. piscine/serbatoi). In un sistema di distribuzione l acqua verrà campionata nei punti distali della rete (rubinetti-docce) e nei serbatoi di accumulo e/o scambiatori di calore. La scelta dei punti e le modalità di campionamento sono in funzione degli obiettivi dell indagine: 13

14 Legionella: come campionare - Pre-flush flush: : un prelievo effettuato dal rubinetto appena aperto, senza scorrimento dell acqua e senza flambatura ( 1 litro) indicativo della contaminazione di quel tratto terminale. - Post-flush flush: : un ulteriore successivo prelievo dopo aver allontanato parti mobili (rompigetto), pulito meccanicamente il punto di sbocco, flambato esternamente e aver fatto scorrere l acqua per almeno 5. Annotare la temperatura nel verbale di prelievo. Questo campionamento può essere indicativo di una colonizzazione all interno dell impianto. - Un prelievo misto raccogliendo nella stessa bottiglia una prima parte in pre-flush e una seconda in post-flush flush,, (1-2 litri), rappresentativo di una realistica situazione all uso. Questo tipo di prelievo appare indicato per le verifiche post bonifica e per le indagini di valutazioni del rischio anche in un contesto di razionalizzazione dei costi. 14

15 Legionella: come campionare Rompigetto/incrostazioni/bulbi docce: : se possibile asportare in modo asettico con strumenti idonei (spatole, pinzette, tamponi) e trasferire in contenitori sterili di adatte dimensioni con l aggiunta giunta di alcuni ml di acqua distillata sterile. Altrimenti consegnare al laboratorio le parti intere avendo cura di lasciare all interno l acqua d origine, trasferendo in sacchetti sterili (tipo presto-chiuso per alimenti). Piscine, cisterne, serbatoi, pozzi : prelievo per immersione con bottiglie sterilizzate in apposite buste/carta autoclavabile. Tamponi: passare le superfici con un tamponcino sterile, con movimenti rotatori, ed inserirlo direttamente in provetta con ml di acqua distillata sterile. Filtri: asportare i filtri, soprattutto se umidi e non sostituiti di recente, inserendoli in sacchetti di plastica sterili, con l aggiunta di 5-10 ml di acqua distillata sterile. Acqua di condensa: : prelevarne la massima quantità possibile con siringhe o pipette sterili. I campioni vanno conservati al buio, a temperatura ambiente, e processati p entro le 24h dal prelievo. In caso non sia possibile eseguire l analisi entro le 24h, mantenere a +4 C. 15

16 Legionella: analisi microbiologica La tecnica di elezione per la ricerca di Legionella in campioni ambientali è quella colturale che prevede le seguenti principali fasi: 1. Preparazione del campione 2. Trattamento di decontaminazione 3. Semina su idonei terreni di coltura 4. Incubazione 5. Lettura con identificazione presuntiva 6. Identificazione definitiva 16

17 Legionella: analisi microbiologica 1. Preparazione del campione: : per l acqua si utilizza la tecnica delle membrane filtranti (MF) che consiste nella filtrazione del campione attraverso membrane in policarbonato o nylon, con porosità 0,22 µm utilizzando apparati di filtrazione come quelli mostrati nelle immagini. 17

18 Legionella: analisi microbiologica 18

20 Legionella: analisi microbiologica 1 litro è, in genere, la quantità minima da filtrare; quantità maggiori possono essere utilizzate e possono richiedere l utilizzo zo di più membrane. Terminata la filtrazione la membrana viene posta in un contenitore sterile di idonee dimensioni (becker( becker), contenente da 5 a 10 ml di acqua campione o di diluente (PBS, PAGE, RINGER) al fine del distacco e della omogenizzazione dei microrganismi che vi sono rimasti trattenuti, che avviene con l aiuto di bacchette sterili a punta arrotondata, eventuale sminuzzamento della membrana con bisturi/forbici sterili e comunque con una energica agitazione passando al vortex per non meno di due minuti. Il campione così ottenuto rappresenta il concentrato da utilizzare per l inoculo. Questa fase è forse la più critica di tutto il processo e può influire in maniera significativa sulla percentuale di recupero delle cellule batteriche. 20

21 Legionella: analisi microbiologica Per piccole quantità, in alternativa alla filtrazione, può essere utilizzata la concentrazione del campione per centrifugazione a 6000 giri per 10, o 3000 per 30, eliminazione del surnatante e risospensione in mezzo e quantità idonee del sedimentato. Per campioni diversi dall acqua l obiettivo è comunque quello di ottenere sempre un concentrato, con sistemi diversi per le varie matrici: - Concrezioni calcaree: : sono frantumate con pestello in mortai di ceramica o vetro, risospese in alcuni ml di acqua distillata sterile e passate al vortex (esame qualitativo o quantitativo come Legionella/gr gr) - Biofilm:tampone disperso in alcuni ml di acqua distillata sterile e agitato vigorosamente al vortex. - Depositi e fanghi : effettuare diluizioni in base 10 (10-1 e 10-2 ) con acqua distillata sterile, agitare bene e inoculare solo le aliquote trattate. 21

22 Legionella: analisi microbiologica 2 Trattamento di decontaminazione, necessario per limitare la flora batterica concomitante. Il concentrato del campione preparato precedentemente viene suddiviso in tre aliquote, di cui due da utilizzare dopo il trattamento ed una da utilizzare tal quale. - trattamento al calore: porre un aliquota in bagnomaria a (50±1) C per (30 ±2) min. - trattamento acido (i metodi ISO e UNICHIM (28) lo prevedono, le linee guida lo propongono) : due metodiche di cui la più semplice è quella di miscelare il campione, in rapporto 1:1, con una soluzione acida a ph 2,2 (HCl+ KCl ) e lasciare a temperatura ambiente per 5 minuti, prima della semina Le tre aliquote, t.q.,., trattata al calore e trattata con acido sono a questo punto pronte per la semina in terreno colturale. 22

23 Legionella: analisi microbiologica 3 4 Semina su terreni di coltura: aliquote da 0,1 a 0,5 ml sono inoculate su piastre di terreno di coltura selettivo MWY o GVPC (29) distribuendo sulla superficie in maniera omogenea con una spatola sterile. Incubazione delle piastre a (36±1) C in termostato, in ambiente umido, con atmosfera arricchita al 2,5% di CO2, per un minimo di 10gg 23

24 Legionella: analisi microbiologica 5 Lettura con identificazione presuntiva: le colonie di Legionella in genere non crescono prima di 3 gg di incubazione su terreno selettivo; si presentano di piccole dimensioni, di colore bianco- grigio, leggermente convesse, con margini regolari, e soprattutto evidenziano il tipico aspetto a vetro smerigliato quando osservate allo stereomicroscopio con luce laterale a bassa intensità. La lettura va eseguita ad intervalli di 2-32 gg, fino al decimo giorno di incubazione. Le colonie con queste caratteristiche sono considerate sospette e vanno trasferite (almeno 3 ufc) ) sia su CYE agar base (o Agar Sangue/ MK) sia su BCYE-α con supplemento (l-( cisteina e ferro) per la crescita differenziale,, incubandole per h a (36±1) C. La presenza di crescita sul terreno con cisteina e l assenza di crescita sul terreno colturale che ne è privo consentono di identificare il microrganismo isolato come PRESUNTA LEGIONELLA 24

26 Legionella: analisi microbiologica 6 Identificazione definitiva : le colonie presunte sono testate con reagenti al latex che consentono di rilevare le specie più frequenti e di interesse clinico ( (Legionella pneumophila SG 1, SG (2-14) e Legionella species : mix di 7 specie); un ulteriore identificazione viene effettuata con sieri singoli, tramite agglutinazione su vetrino oppure con la tecnica di immunofluorescenza diretta. La tipizzazione deve essere eseguita almeno su una decina di colonie aventi le stesse caratteristiche. Il numero di Legionelle è stimato sulla base del conteggio più alto ottenuto dai vari trattamenti ( t.q.,., calore, acido); il risultato, tenuto conto del fattore di concentrazione e delle eventuali diluizioni, è espresso come UFC/L. (31) 26

27 Legionella: riferimenti utili European Guideline for Control and Prevention of Travel Associated Legionnaires Disease Documento Linee-guida per la prevenzione e il controllo della legionellosi (Conferenza Stato Regioni) Provvedimento G.U. serie n.28 Linee guida recanti indicazioni ai laboratori con attività di diagnosi microbiologica a e controllo ambientale della legionellosi (Conferenza Stato Regioni) Provvedimento G.U. serie n. 29 Linee guida recanti indicazioni sulla legionellosi per i gestori di strutture turistico ico- ricettive e termali (Conferenza Stato Regioni) Delibera della Giunta Regionale n. 326 del : approvazione linee guida inerenti la Sorveglianza della Legionellosi in Liguria. 27

28 Legionella: riferimenti utili Metodo Unichim n. 1037:2002 acque destinate al consumo umano Ricerca e determinazione di Legionella pneumophila Metodo ISO 11731:1998 Water quality- Detection and enumeration of Legionella Metodo ISO :2004 Water quality- Detection and enumeration of Legionella Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts DDS Università di Genova Laboratorio di riferimento Regionale ISS Roma Laboratorio di riferimento Nazionale

29 Legionella: allegato terreni di coltura CYE Agar base: : carbone attivo (charcoal( charcoal) ) + estratto di lievito + agar. BCYE-α supplemento di crescita: : tampone ACES/idrossido di potassio, pirofosfato ferrico, l-cisteina cloridrato, α-chetoglutarato. MWY supplemento selettivo:glicina, vancomicina, polimixina B, anisomicina, blu di bromotimolo, porpora bromocresolo. GVPC supplemento selettivo: glicina, vancomicina, polimixina B, cicloeximide. 29

30 Legionella: allegato terreni di coltura La glicina indebolisce la parete cellulare favorendo l azione degli antibiotici Polimixina B inibisce i batteri Gram Vancomicina inibisce i batteri Gram + Anisomicina contenuta in MWY ha azione inibitoria sui lieviti Cicloeximide contenuto nel GVPC è un antifungino, è tossico (epatotossico)) al contatto e per inalazione. 30

31 Legionella: esempio di stima quantitativa UFC/L = n v 1 i s n = numero colonie piastra, v = volume (ml) del concentrato i = volume (ml) dell inoculo S = volume ( in litri) di campione filtrato Esempio di calcolo: : filtrato 1 litro, membrana risospesa in 10 ml inoculo 0,1 ml, crescita di 1 U.F.C: (n x v):i x 1:s = 1 x 10 x 10 = 100 UFC/litro Aumentando l inoculo, es. a 0,5 ml (n x v):i x 1:s = 1 x 2 x 10 = 20 UFC/litro Diminuendo la diluizione della membrana, es. in 5 ml (n x v):i x 1:s = 1 x 2 x 5 = 10 UFC/litro Aumentando il campione filtrato, ad es. 2 litri (n x v):i x 1:s = 1 x 2 x 5 : 2 = 5 UFC/litro 31