IDENTIFICAZIONE DI SPECIE LEGIONELLA

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1 METODO NAZIONALE STANDARD IDENTIFICAZIONE DI SPECIE LEGIONELLA BSOP ID 18 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 1 di 11 Rierimento no: BSOP ID 18i2

2 STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buono standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro sviluppo successivo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite all indirizzo Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2007). Identification of legionella species. National Standard Method BSOP ID 18 Emissione 2. Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 11

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE... 5 INFORMAZIONE TECNICA CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA MICRORGANISMI BERSAGLIO IDENTIFICAZIONE ASPETTO MICROSCOPICO TERRENI DI ISOLAMENTO PRIMARIO ASPETTO COLONIA PROCEDURE DI PROVA IDENTIFICAZIONE SUCCESSIVA CONSERVAZIONE E RIFERIMENTO DIAGRAMMA DI FLUSSO REFERTAZIONE..., IDENTIFICAZIONE PRELIMINARE CONFERMA IDENTIFICAZIONE MEDICO MICROBIOLOGO CCDC CENTRO PER INFEZIONI GRUPPO CONTROLLO INFEZIONI. 9 6 RIFERIMENTI LABORATORIO DI RIFERIMENTO RINGRAZIAMENTI E CONTATTI BIBLIOGRAFIA Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 11

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato BSOP D 18 identificazione delle specie Legionella Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Modifica 2/ Prima pagina Aggiunto il logo dell Irlanda del Nord 5 Informazione tecnica Aggiunta al diagramma di flusso L. oakridgensis 8 Diagramma di flusso Titolo cambiato e diagramma di flusso in formato Visio. Contenuto modificato 9 6 Riferimenti Inserito collegamento ai manuali d uso del laboratorio di riferimento 11 Bibliografia Bibliografia revisionata ed aggiornata Tutte Tutte Inseriti collegamenti PDF per i documenti dei MNS Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 11

5 SCOPO DEL DOCUMENTO IDENTIFICAZIONE DI SPECIE LEGIONELLA Questo Metodo Nazionale Standard (MNS) descrive l identificazione preliminare a livello di specie di Legionella isolate da campioni clinici. Per informazioni sulla tipologia dei campioni da utilizzare per la ricerca delle specie Legionella consultare BSOP 47 - Investigation of specimens for Legionella species Nella maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica la completa identificazione delle specie Legionella non è economicamente vantaggiosa e gli isolati devono essere inviati al Laboratorio di Riferimento. INTRODUZIONE Tassonomia La famiglia delle Legionellaceae include 52 specie ed oltre 60 sierogruppi 2. La Legionella pneumophila è responsabile del 95 percento delle infezioni da specie Legionella. Sono noti 16 sierogruppi of L. pneumophila, ma il ceppo 1 rappresenta la maggior parte degli isolati da infezione nell uomo 3. Caratteristiche La famiglia delle Legionellaceae è costituita da bastoncini Gram negativi pleiomorfi a debole colorazione. Generalmente assumono l aspetto di coccobacilli nei tessuti o nelle secrezioni, ma nelle colture possono essere di aspetto filamentoso. Sono aerobi e non si sviluppano su agar sangue o in agar tamponato carbone estratto di lievito privo di cisteina. La presenza nel terreno di ferro solubile può favorire la loro crescita 2. L attività biochimica dei componenti del genere è relativamente inerte, sono catalasi positivi, (alcuni debolmente), ossidasi-variabili e possiedono flagelli polari. Alcune specie diverse dalla L. pneumophila appaiono fluorescenti blu-bianche alla luce UV (360nm ± 20nm) mentre altre presentano una debole fluorescenza gialla 4 o rosso mattone. Principi di identificazione Le colonie di Legionella isolate su agar selettivo sono identificate per l aspetto della colonia, colorazione Gram e richiesta di cisteina per la crescita. Tutti gli isolati da campioni clinici devono essere inviati al Laboratorio di Riferimento per la conferma e successiva identificazione. INFORMAZIONE TECNICA I laboratori devono sapere che alcuni ceppi adattati di laboratorio di L. oakridgensis perdono la richiesta di L-cisteina per il loro sviluppo. Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 11

6 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA 5-15 Le specie Legionella appartengono al Gruppo di Rischio 2 sebbene, per il particolare tipo di lavoro con L. pneumophila, in alcuni casi possano essere richieste complete condizioni di Contenimento di Livello 3. Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza nella manipolazione dei microrganismi documentati in questo MNS. I microrganismi infettano principalmente per via respiratoria. Gli isolati sospetti di specie Legionella devono sempre essere manipolati in cabina microbiologica di sicurezza. Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza microbiologica. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto. 2 MICRORGANISMI BERSAGLIO Specie Legionella 3 IDENTIFICAZIONE 3.1 ASPETTO MICROSCOPICO Colorazione Gram (consultare BSOPTP 39 - Staining Procedures) Bastoncini Gram negativi scarsamente colorati, assumono forma filamentosa nelle colture vecchie. Eseguire la colorazione Gram solo da piastre di agar contenenti cisteina. 3.2 TERRENI DI ISOLAMENTO PRIMARIO Agar base-carbone-estratto di lievito tamponato (BCYE - buffered-charcoal-yeast extract agar base) arricchito con tampone ACES, L-cisteina e BMPA (cefamandolo, polimixina B e anisomicina) incubato per 10 giorni in atmosfera umida a C (BSOP 47 - Investigation of specimens for Legionella species). 3.3 ASPETTO COLONIA Utilizzare un microscopio binoculare a basso ingrandimento con luce incidente ad angolo acuto sulla superficie dell agar. Le specie Legionella producono colonie con caratteristico aspetto di vetro smerigliato. Anche disponendo di un microscopio per piastre, è comunque richiesto un minimo di 36 ore per poter visualizzare le colonie. La piastra controllata a 24 ore fornirà informazioni sulla posizione, numero e morfologia dei contaminanti. Ciò contribuirà all eliminazione delle colonie sospette che dovranno in seguito essere indagate se le piastre non saranno verificate fino alla terza giornata. I margini delle colonie sono continui e di solito iridescenti a chiazze verdi o rosa porpora. Il colore delle colonie può assumere ombreggiature variabili porpora, verdi o arancio ed i colori dipendono dallo spessore dell agar della piastra e dall età della coltura (invecchiando le colonie assumono il colore verde). Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 11

7 3.4 PROVE PRELIMINARI Sottocolture su agar selettivo e non selettivo per Legionella. Le specie Legionella si sviluppano su agar base per Legionella (BCYE) arricchito con tampone ACES, L-cisteina. Le specie Legionella non si sviluppano sullo stesso terreno privo di L-cisteina. Lo sviluppo su entrambe le piastre indica che non si tratta di specie Legionella. Consultare Informazione Tecnica. Seminare ciascuna piastra di agar con un ansa sterile diffondendo l inoculo per ottenere la sviluppo di colonie isolate (consultare QSOP 52 - Inoculation of culture media (formerly BSOP 54) ) Le colonie esaminate su BCYE con luce UV (366 nm) possono rilevare la presenza di pigmento giallo o auto-fluorescenza. Le colonie dopo sottocoltura, colorazione Gram e catalasi possono essere giudicate solo in via preliminare, fino a quando confermate dal laboratorio di riferimento. 3.5 IDENTIFICAZIONE SUCCESSIVA Utilizzare una confezione commerciale (lattice o DFA Immunofluorescenza diretta) sull isolato sospetto; queste prove forniscono una identificazione preliminare confortata dal successivo referto del Laboratorio di Riferimento. 3.5 CONSERVAZIONE ED INVIO Per l invio al Laboratorio di Riferimento isolare una coltura pura su becco di clarino di Legionella agar base con tampone ACES e L-cisteina, oppure in sospensione densa in acqua sterile (non fisiologica). Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 11

8 4 - DIAGRAMMA DI FLUSSO Campioni clinici Piastra di isolamento primario Carbone estratto di lievito tamponato (BCYE) supplementato con tampone ACES contenente L- cisteina Agar BMPA Colonie smerigliate con margine iridescente verde porpora dopo almeno 36 ore di incubazione. Colonie fluorescenti sotto luce UV Sottocolture di ciascun tipo di colonia su: Agar BCYE con tampone ACES e L-cisteina BCYE senza L-cisteina Sviluppo su agar BCYE con tampone ACES, L-cisteina e BMPA Assenza di crescita su BCYE privo di L-cisteina Crescita su agar BCYE con ACES senza L- cisteina Colorazione Gram Su coltura pura Colorazione di Gram dal solo terreno contenete cisteina Bastoncini Gram negativi (possibile sviluppo di forme filamentose) Scartare microrganismi con colorazioni Gram diverse Non specie Legionella Scartare NB: alcuni ceppi di laboratorio adattati di L. oakridgensis hanno perso la necessità di L-cisteina Presunta specie Legionella Utile identificazione successiva se clinicamente richiesto, confezione identificazione commerciale o IFAT o DFAT od invio al Laboratorio di Riferimento. Se opportuno isolare un ceppo puro su agar legionella a becco di clarino (con tampone ACES e L-cisteina) o preparare una densa sospensione in acqua sterile (non fisiologica) Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 11

9 5 REFERTAZIONE 5.1 IDENTIFICAZIONE PRELIMINARE Se rilevate appropriate caratteristiche di crescita, aspetto delle colonie, colorazione Gram della coltura. 5.2 CONFERMA IDENTIFICAZIONE N/D 5.3 MEDICO MICROBIOLOGO 5.4 CCDC Informare il medico microbiologo di tutte le specie isolate presunte Legionella. Informare il medico microbiologo di tutte le specie isolate confermate Legionella. Seguire i protocolli locali per la refertazione al clinico. Fare riferimento al Memorandum locale di iinformazione. 5.5 CENTRO PER INFEZIONI 16 Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle indicazioni del COSURV. 5.6 GRUPPO CONTROLLO INFEZIONI Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati nuovi o presunti di specie Legionella. 6 RIFERIMENTI Per informazioni sugli accertamenti disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altre, riguardanti il laboratorio di riferimento, rivolgersi a: Respiratory and Systemic Infections Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency 61 Colindale Avenue London NW9 5HT Contattare il centralini principale del CFI: Tel. +44 (0) Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 9 di 11

10 7 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questo Metodo Nazionale Standard è stato sviluppato, revisionato e controllato dallo Standard Methods Working Group for Bacteriology (http://www.hpastandardmethods.org.uk/wg bacteriology.asp). Si ringraziano per la collaborazione i numerosi operatori dei laboratori di batteriologia e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento, ed il Redattore Medico per la revisione finale. I Metodi Nazionali Standard Method sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per altre informazioni prendere contatti con: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale London NW9 5EQ Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 10 di 11

11 BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Bangsborg JM. Antigenic and genetic characterization of Legionella proteins: contributions to taxonomy, diagnosis and pathogenesis. [Review] [450 refs]. APMIS Supplementum 1997;70: Stout JE, Yu VL. Legionellosis.[comment]. [Review] [87 refs]. New England Journal of Medicine 1997;337: Vickers RM, Yu VL. Clinical laboratory differentiation of Legionellaceae family members with pigment production and fluorescence on media supplemented with aromatic substrates. Journal of Clinical Microbiology 1984;19: Advisory Committee on Dangerous Pathogens Approved List of Biological Agents. p Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; NHS Estates. Health Building Note 15. Facilities for pathology services. 2nd ed. London: The Stationary Office; BS EN 12469: Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); BS 5726: Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; Health Protection Agency. Laboratory Reporting to the Health Protection Agency. Guide for diagnostic laboratories. February Revisione no: 2 Data di revisione Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 11 Riferimento no: BSOP ID 18i2 Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection

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