Colorazioni e test biochimici in microbiologia

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1 Colorazioni e test biochimici in microbiologia

2 Le colorazioni in Microbiologia Perché colorare? La cellula batterica è trasparente contrasto insufficiente tra cellula batterica ed ambiente circostante. I coloranti debbono consentire: forte contrasto tra i microrganismi ed il fondo differenziazione di vari tipi morfologici (forma, organizzazione, colorazione Gram) evidenziazione di alcune strutture (flagelli, capsule, endospore)

3 Le colorazioni in Microbiologia I coloranti I coloranti constano di ioni (positivi o negativi). Al riguardo, essi possono essere suddivisi in: Coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana, cristalvioletto, tionina): Carica positiva (superficie cellulare, proteine, acidi nucleici) colorazione diretta Affinità per le strutture acide Coloranti acidi (eosina, negrosina, rosso Congo): Carica negativa Affinità per le strutture basiche, si depositano attorno al microrganismo colorazione indiretta o negativa

4 Le colorazioni in Microbiologia Preparativa Preparazione di soluzioni coloranti Soluzione alcoolica (colorante come sale): 10 g sostanza colorante ml alcool assoluto Soluzione idroalcoolica 10% (colorante subisce dissociazione elettrolitica): 10 ml soluzione alcoolica madre colorante + 90 ml H 2 O distillata Reagenti per colorazioni Mordenzanti, sostanze che fissano il colorante od amplificano l ingombro del campione: fenolo, soluzione iodo-iodurata (LUGOL) Differenziatori, sostanze decoloranti: alcoolacetone, acido solforico al 20%

5 Le colorazioni in Microbiologia Tipologie di colorazione Colorazioni PROGRESSIVE: si eseguono con soluzioni molto diluite di colorante, interrompendo tempestivamente la colorazione Colorazioni REGRESSIVE: si eseguono con una ipercolorazione e si usa poi un differenziatore la cui azione decolorante va interrotta tempestivamente

6 Le colorazioni in Microbiologia Tecniche di colorazione Colorazioni SEMPLICI: un colorante basico (blu di metilene, fucsina fenicata) viene applicato al campione fissato per un tempo variabile. L eccesso di colorante viene eliminato tramite risciacquo con acqua Consente di rilevare la morfologia e l organizzazione cellulare Colorazioni DIFFERENZIALI: due o più coloranti ed altri reagenti (mordenzanti, differenziatori) consente di distinguere due differenti tipologie di microrganismi o 2 differenti strutture di un microrganismo

7 Tecniche di colorazione Colorazioni DIFFERENZIALI Colorazione di Gram Colorazioni per bacilli acido-resistenti: Metodo di Ziehl-Neelsen Metodo a freddo di Kinyoun (carbolfucsina a freddo) Metodo della fluorescenza con auramina Colorazione della capsula (inchiostro di china) Colorazione di flagelli (Leifson) Colorazione di spore Colorazione di lieviti e funghi Colorazione di spirochete

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9 Le colorazioni in microbiologia Allestimento di un preparato (1 di 2) Porre un ansata di colonia (o sospensione) batterica al centro di un vetrino pulito Se si preleva il materiale da terreno agarizzato, aggiungere una goccia di acqua distillata al campione

10 Le colorazioni in microbiologia Allestimento di un preparato (2 di 2) Aiutandosi con un ansa, stemperare il campione nell acqua e stendere il preparato a coprire circa la metà della superficie del vetrino (preparazione dello smear) Lasciare asciugare il preparato all aria o tramite calore (Bunsen). Fissare il preparato passando il vetrino 4-5 volte direttamente sulla fiamma

11 Colorazione

12 Hans Christian Joachim Gram Batteriologo danese ed inventore della colorazione di Gram (nel tentativo di differenziare Klebsiella pneumoniae dagli pneumococchi) Nato a Copenhagen il 13 Settembre1853.

13 Colorazione di Gram Tecnica

14 Colorazione di Gram Principio Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all interno della cellula. Il decolorante condensa per disidratazione la struttura petidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene catturato dalla parete cellulare Nei batteri Gram- il decolorante, agendo come solvente lipidico, dissolve la membrana esterna alla parete cellulare così permettendo il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

15 Colorazione di Gram Osservazione microscopica I batteri Gram+ appaiono blu (Staphylococcus epidermidis) I batteri Gram- appaiono rossi (Escherichia coli)

16 Colorazione di Gram Utilità clinica (1 di 2) Idoneità del campione da sottoporre a coltura Diagnosi eziologica presuntiva meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene Suggerire la necessità di attuare tecniche non routinarie anaerobi, funghi Ausilio nella interpretazione dell esame colturale angina di Vincent (spirochete, fusobatteri) paziente antibiotizzato Informazioni sulla natura dell infezione infezioni poli-microbiche

17 Colorazione di Gram Utilità clinica (2 di 2) Quindi: La conoscenza del risultato di una colorazione di Gram può salvare una vita! Tuttavia: La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quella commensale La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di: Legionella spp. (immunofluorescenza) bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl- Neelsen)

18 Colorazione di Gram: l eccezione La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i batteri. Esempi consistono nel Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae Incapacità di colorare per la natura cerosa dell involucro esterno, altamente impermeabile ai coloranti Colorazione di Ziehl-Nielsen

19 Mycobacterium spp. Parete cellulare Composizione: Grosse quantità di glicolipidi: acido micolico (60%) complessi lipidiarabinogalattani lipoarabinomannani Scarso petidoglicano

20 Mycobacterium spp. Parete cellulare Funzioni: Forma e prevenzione lisi osmotica (peptidoglicano) Inibizione ingresso composti chimici Crescita lenta Maggiore resistenza agli agenti chimici Maggiore resistenza alla fagocitosi Induzione sintesi citochine (TNF- ) da parte dell acido micolico

21 Le colorazioni in microbiologia Colorazione di Ziehl-Neelsen Presenza caratteristica di ceramidi e fosfolipidi sulla superficie cellulare di Mycobacterium spp. e Nocardia spp. I coloranti ordinari non possono superare lo strato cerato. Colorazioni con la tecnica per l acido-resistenza: Kinyoun Ziehl-Neelsen

22 Colorazione di Ziehl-Neelsen (carbolfucsina a caldo) Tecnica (1 di 2) Step 1: Versare la fucsina basica Step 2: Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 min Lavare con acqua

23 Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica (2 di 2) Step 3: Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min) Lavare con acqua Step 4: Contrastare con blu di metilene per 1-2 min Lavare con acqua

24 Colorazione di Ziehl-Neelsen Osservazione microscopica Gli organismi acido-resistenti (AFB=acid fast bacilli) appaiono colorati in rosso Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

25 Colorazione per bacilli alcool-acido resistenti (BAAR) Fotografia al microscopio di un campione polmonare colorato mediante Ziehl-Neelsen che dimostra la presenza di cellule di Mycobacterium tubercolosis. Nell immagine i micobatteri si presentano come bacilli rossi alcool-acido resistenti (BAAR)

26 Le colorazioni in Microbiologia Colorazioni speciali La colorazione negativa viene usata quando un organismo od una sua struttura non viene colorata facilmente come, ad esempio, in presenza di capsula. La colorazione delle spore richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante La colorazione dei flagelli richiede un mordenzante per ispessire la struttura flagellare

27 La colorazione negativa Dimostrazione della presenza di capsula in Acinetobacter sp. mediante contrasto negativo con inchiostro di china ed osservazione al microscopio a contrasto di fase.

28 Bacterial capsules visualized by various techniques Left. Streptococcus pneumoniae -India ink (A black pigment) capsule outline ; S. pneumoniae capsular material is composed of polysaccharide. The capsule is the pathogen's most important determinant of virulence because it allows the bacterial cells to escape phagocytes in the lung. Middle. Bacillus anthracis - fluorescent-tagged antibody (CDC); the B.anthracis capsule is composed of poly-d-glutamic acid. Its capsule is antiphagocytic, and it protects the bacteria from complement- mediated lysis in serum or blood. Rigth. Negative stain (India Ink outline) of the capsule of Bacillus anthracis. CDC.

29 Flagellar stains of three bacteria a. Bacillus cereus b. Vibrio cholerae c. Bacillus brevis Since the bacterial flagellum is below the resolving power of the light microscope, although bacteria can be seen swimming in a microscope field, the organelles of movenent cannot be detected. Staining techniques such as Leifson's method utilize dyes and other components that precipitate along the protein filament and hence increase its effective diameter. Flagellar distribution is occasionally used to differentiate between morphologically related bacteria. For example, among the Gram-negative motile rod-shaped bacteria, the enterics have peritrichous flagella while the pseudomonas have polar flagella.

30 Le colorazioni in Microbiologia Colorazione di flagelli Colorazione di Leifson. Cellule di Helicobacter pylori Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997) In this study, using the Leifson tannic acid-fuchsin method, we performed touch cytology on smears obtained from gastric biopsies to demonstrate H. pylori flagella (da:

31 Tecnica di Schaeffer-Fulton per la colorazione delle Endospore Le spore sono impermeabili ai coloranti e possono essere colorate solo con tecniche specifiche. Colorante principale: verde malachite Secondo colorante (di contrasto): safranina La penetrazione del colorante principale nelle spore è facilitata bollendo il campione per 4-5 minuti Dopo aver lavato con acqua: le spore trattengono il colorante principale e rimangono colorate di verde le cellule vegetative invece non trattengono il colorante e rimangono incolori; vengono evidenziate aggiungendo il secondo colorante che le colora di rosso

32 Spore di Bacillus species colorate con la tecnica di Schaeffer-Fulton Mature spores stain green whether free or still inside the vegetative sporangium. Vegetative cells and sporangia stain red. The Schaeffer-Fulton stain technique was applied. The primary stain, malachite green, is forced into the spores by heating the prepared slide to boiling for 4-5 minutes. After washing, the vegetative cells are counterstained with safranine.

33 Bacillus subtilis - Endospore stain Principle: Spores have a durable outer coating that is composed of the protein keratin. This keratin coat resists staining so in order to stain a spore the primary stain, malchite green, must be heated to drive the stain into the spores. Vegatative cells are then decolorized with water and 0.5% safranin is used to counterstain. Thus endospores are stained green, while vegetative cells are stained red.

34 Colorazione spirochete Borrelia osservata al mo in campo oscuro Treponema pallidum, the spirochete that causes syphilis. Silver stain. CDC. Due spirochete al microscopio a fluorescenza. L'evidenziazione dei microrganismi nel campione di sangue è resa possibile dall'arancio di acridina contenuto nel capillare che li colora in modo caratteristico ed inequivocabile durante l'osservazione del capillare al microscopio a fluorescenza. Le spirochete possono essere visualizzate mediante esame in campo oscuro o tramite colorazione di Giemsa o di Wright su goccia spessa e su striscio di sangue (metodi batterioscopici x sangue). (L'esame del sangue e dei tessuti con arancio di acridina è più sensibile degli strisci di sangue periferico colorati con Wright o con Giemsa.)

35 Tests biochimici In microbiologia saggiando i prodotti chimici finali di processi enzimatici e rivelando la scomparsa di alcune sostanze dal terreno di coltura è possibile stabilire il profilo enzimatico di una specie microbica, ed è possibile identificare e differenziare il microrganismo da specie affini. I microrganismi si possono diversificare sia in base al tipo di zucchero che fermentano, ma soprattutto in base ai diversi prodotti finali che formano tra i quali: acidi organici (acido lattico, acetico, e butirrico), composti neutri (alcol etilico, acetone, alcol butilico) e diversi gas (metano, H2, CO2). Le specie batteriche possono essere differenziate anche in base alle loro capacità proteolitiche, cioè in base alla capacità di degradare proteine, come ad esempio la gelatina, e di utilizzare amminoacidi e peptidi che ne derivano per produrre energia.

36 TEST della CATALASI sospetta colonia di Stafilococco Catalasi + H 2O 2 effervescenza Alcuni batteri posseggono l'enzima catalasi, che scinde il perossido di idrogeno (H2O2) in O2 e H2O. Il perossido di idrogeno è comunemente formato per via biochimica durante i processi respiratori per mezzo della riduzione dell'ossigeno con due elettroni mediata dalle flavoproteine. Quasi tutti i microrganismi che crescono aerobicamente producono piccole quantità di perossido. Essi sono però capaci di neutralizzarlo mediante l'intervento della catalasi. Risposta di alcuni batteri: Bacillus, Micrococcus/Staphylococcus = +; Clostridium, Streptococcus = -.

37 TEST della CATALASI

38 Test di attività della COAGULASI Per l identificazione di S. aureus I batteri che producono questo enzima lo utilizzano come meccanismo di difesa; In presenza di un fattore plasmatico le coagulasi convertono il fibrinogeno in fibrina, coagulano l area di plasma intorno ad essi, proteggendo cosi il batterio dalla fagocitosi Il test è effettuato inoculando i batteri, in presenza di plasma, a 37 C per qualche ora, la formazione di un coagulo indica la positività al test A sin. S. aureus A dx: Altri Staphylococcus spp.

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40 PROVA della COAGULASI Test su vetrino Coagulasi legata Test in provetta Coagulasi libera e legata

41 TEST dell OSSIDASI un altro enzima respiratorio utilizzato spesso per l identificazione di specie di Neisseria e Pseudomonas è l OSSIDASI, questo enzima è in grado di ossidare ammine-aromatiche con produzione di composti colorati. Il test si effettua facendo cadere su una colonia ben isolata su terreno solido, o su di un ansata di batteri posta su carta da filtro il reattivo contenente le ammine-aromatiche, la comparsa di un colore porpora indica la positività della reazione.

42 .. ALTRI TESTS BIOCHIMICI ß-emolisi

43 DNasi (Desossiribonucleasi) Alone chiaro per depolimerizzazione del DNA contenuto nel terreno

44 Termonucleasi (DNAsi termoresistente)

45 Test del citrato su agar citrato di Simmons Scissione del citrato in acido organico e CO2 Viraggio da verde a blu per formazione di sodio carbonato Synthetic test agar proposed by SIMMONS (1926) for the identification of microorganisms (particularly of Enterobacteriaceae and certain fungi) on the basis of their metabolism of citrate, being the sole carbohydrate source. Il terreno è particolarmente indicato per differenziare le salmonelle citrato positive (S. enteritidis e salmonelle dei sottogeneri II, III, IV) dalle salmonelle citrato negative (S. typhi, S. paratyphi, S. pullorum, S. gallinarum). E.coli e Shigella : -

46 Test ureasi Il test dell'ureasi avviene su terreni di Christensen. Si fa un pesante inoculo. Il terreno vira al rosa in tempi fissi a seconda della specie. B. abortus vira rapidamente

47 test di determinazione dell attività b-galattosidasica La b-galattosidasi è un enzima intracellulare che idrolizza il legame b-glicosidico che unisce glucosio e galattosio in una molecola di lattosio, il quale entra nella cellula ad opera della galattosio-permeasi. L attività b-galattosidasica è legata ad enzimi inducibili, cioè prodotti solo in presenza di un substrato specifico.

48 test di determinazione dell attività b-galattosidasica I batteri che fermentano il lattosio posseggono entrambi gli enzimi ed idrolizzano rapidamente il lattosio. I batteri non fermentanti il lattosio ne sono sprovvisti. I batteri tardo-fermentanti il lattosio mancano della permeasi, ma posseggono la b-galattosidasi che essendo inducibile può essere svelata addizionando al terreno di coltura un substrato analogo al lattosio come l ONPG: o-nitrofenil b-d-galattopiranoside; se il batterio ha attività b-galattosidica l ONPG incolore verrà idrolizzato e libererà un composto di colore giallo. L ONPG è un composto simile al lattosio che passa però nella cellula per diffusione osmotica, in presenza di b-galattosidasi viene scisso producendo l ONP di colore giallo. I batteri non fermentanti il lattosio sono privi di entrambi gli enzimi e non idrolizzano l ONPG.

49 Test ONPG 1. Positive Colony (Enterobacter, Escherichia) 2. Negative Colony (Proteus) 3. Negative Colony (Salmonella) 4. Negative Control

50 Identificazione di batteri e lieviti: Sistemi automatici e semiautomatici Vitek Enterotube Lettura computerizzata API I sistemi miniaturizzati, forniti da diverse case produttrici (es. Roche, Biomerieux, Minitek, ecc.) hanno il vantaggio di fornire una serie di terreni, in cui si evidenziano differenti attività biochimiche, in un'unica soluzione che possono essere inoculati tutti in una volta e letti in un tempo molto breve (circa 24h).

51 ENTEROTUBE: METODICA OBIETTIVO: L enterotube è un sistema pronto all impiego per l identificazione rapida delle Enterobacteriacae che consente l esame simultaneo di 15 differenti caratteristiche biochimiche dei batteri. PRINCIPIO: Gli enterobatteri vengono identificati in base alla valutazione dei risultati di diverse prove biochimiche: - fermentazione del destrosio e produzione di gas - decarbossilazione della lisina - decarbossilazione dell ornitina - fermentazione del triptofano e produzione di H2S - fermentazione dell adonitolo - fermentazione del lattosio - fermentazione dell arabinosio - fermentazione del sorbitolo - fermentazione del glucosio (Voges-Proskauer) - fermentazione del dulcitolo e della fenilalanina - idrolisi dell urea - utilizzazione del citrato MATERIALI E STRUMENTI: MATERIALI BIOLOGICI Colture microbiche di Escherichia coli, Proteus, Enterobacter aerogenes,... MATERIALI CHIMICI Reattivo di Kovacs, alfa-naftolo (6% in alcool etilico), idrato di potassio (40g in 60ml di acqua) TERRENI DI COLTURA Kit enterotube VETRERIA,... Portaprovette, siringhe sterili STRUMENTI Termostato, bunsen

52 ENTEROTUBE: METODICA STEP 1 Accanto alla fiamma del bunsen svitare i cappucci dell enterotube e con la punta dell ago prelevare una colonia isolata.

53 ENTEROTUBE: METODICA STEP 2, 3 e 4 Inoculare l enterotube ruotando ed estraendo l ago attraverso tutti gli scomparti del tubo. Reinserire l ago fino alla tacca e poi spezzarlo piegandolo. La parte di ago che rimane all interno assicura l anaerobiosi. Con lo spezzone dell ago perforare la pellicola di plastica in corrispondenza dei fori degli ultimi 8 scomparti al fine di creare un ambiente aerobio. Riavvitare i tappi.

54 ENTEROTUBE: METODICA STEP 5 Incubare a C per h possibilmente in posizione verticale su un portaprovette

55 ENTEROTUBE: METODICA STEP 6 Registrare le reazioni (+ o -) e riportarle nella tabella

56 ENTEROTUBE: METODICA STEP 7 Eseguire il test dell indolo iniettando con una siringa 4 gocce di reattivo di Kovacs direttamente sotto la pellicola di plastica dello scomparto H2S/indolo (il reattivo vira al rosso se la prova è positiva). Un importante test che consente di differenziare tra specie di Enterobatteri come, E. coli (+), Klebsiella ed Enterobacter (-), è il test di produzione dell INDOLO. L indolo è un prodotto del metabolismo del triptofano, alcuni microrganismi sono capaci di ossidare il triptofano presente nel terreno di coltura per bisogni nutrizionali grazie all enzima triptofanasi producendo un benzopirrolo detto indolo. Test in provetta

57 ENTEROTUBE: METODICA STEP 8 Eseguire il test di Voges-Proskauer iniettando con una siringa 3 gocce di soluzione di alfa-naftolo e 2 gocce di KOH direttamente sotto la pellicola di plastica dello scomparto VP (il reattivo vira al rosso entro 10 minuti se la prova è positiva). Discrimina tra Klebsiella e Enterobacter (+) da Escherichia (-). Caratterizza i ceppi di Bacillus. Terreno di coltura costituito da acqua peptonata, fosfati e glucosio;a crescita avvenuta, aggiunta di alfa-naftolo e KOH; l acetilmetilcarbinolo, in presenza di KOH e aria, si ossida a diacetile; questo reagisce con l alfa-naftolo e con un prodotto di rottura dell arginina presente nel peptone e dà origine ad un composto di colore rosso.

58 ENTEROTUBE: RISULTATI