SCREENING MICROBIOLOGICO E TOSSICOLOGICO. Dott.ssa Donatella GIACOSA Responsabile Laboratorio Biologico SMAT SpA

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Florindo Locatelli
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1 SCREENING MICROBIOLOGICO E TOSSICOLOGICO Dott.ssa Donatella GIACOSA Responsabile Laboratorio Biologico SMAT SpA

2 Un sondaggio sulle performance di alcuni agenti contaminanti

3 Performances di alcuni agenti contaminanti AGENTE UTILIZZATO Concentrazione in mg/litro per EFFETTO ACUTO (con ingestione di 0,5 litri) m 3 Arsenico kg Cianuro kg Tossina botulinica 0,14 Sarin 0,05 1,4 kg 0,50 kg Salmonella typhi bact g

ON-LINE LAGUNAGGIO: Ingresso laguna Uscita laguna 14 parametri CF, monitoraggio radioattività e

4 MONITORAGGIO IN CONTINUO presso SMAT LABORATORIO ON-LINE CENTRO RICERCHE: Acqua grezza (impianti Po) Acqua potabile (Po1, Po2, Po3, La Loggia) 52 parametri CF, monitoraggio biotossicologico LABORATORIO ON-LINE LAGUNAGGIO: Ingresso laguna Uscita laguna 14 parametri CF, monitoraggio radioattività e biotossicologico MONITORAGGIO BIOTOSSICOLOGICO IN CONTINUO 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0

5 PUNTI DI FORZA DEL MONITORAGGIO IN CONTINUO Rileva in tempo reale variazioni nella qualità dell acqua, situazioni di allarme e di allerta Permette di intervenire sul trattamento di potabilizzazione Coopera alla protezione dell ambiente Diminuisce i costi analitici e PROPRII DEL MONITORAGGIO TOSSICOLOGICO IN CONTINUO Esamina l acqua «nel suo insieme», tenendo conto delle reciproche interferenze dei contaminanti Esamina gli organismi tester nel loro habitat, in riferimento alla loro «salute»

Caratteristiche del test della chemiluminescenza Vantaggi Rilevazione presenza contaminanti tossici Semplice, rapido, idoneo all applicazione in campo

6 Caratteristiche del test della chemiluminescenza Vantaggi Rilevazione presenza contaminanti tossici Semplice, rapido, idoneo all applicazione in campo Aspetti problematici Scarsamente confrontabile con altri test di tossicità Strumentazione dedicata Molti interferenti (sodio tiosolfato, cloro, ammoniaca)

7 Caratteristiche del test di tossicità batterico (Vibrio fischeri) Strumentazione dedicata Sensibilità Vantaggi Rilevazione presenza contaminanti tossici Semplice, rapido, diffuso, affidabile Differenti tipi di test (screening, comparazione, curva dose/risposta) Aspetti problematici

8 Caratteristiche dei test di tossicità con crostacei Vantaggi Rilevazione presenza contaminanti tossici Semplice Strumentazione normalmente in dotazione ai laboratori (termostati, lampade, stereomicroscopio) Aspetti problematici Durata (compresa la riattivazione)

9 Caratteristiche dei test immunocromatografici Vantaggi Utilizzo in campo Semplice, rapido Aspetti problematici Sensibilità test qualitativo

Escherichia Salmonella Vibrio Fecali INTENZIONALE Brucella spp.

10 Saprofiti CLASSICA Batteri Opportunisti Aeromonas Staphylococcus Pseudomonas (in foto) CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA Patogeni Legionella Escherichia Salmonella Vibrio Fecali INTENZIONALE Brucella spp. Vibrio cholerae Francisella tularensis Yersinia pestis Campylobacter spp. Bacillus anthracis (in foto)

11 Principio di valutazione dell ATP ATP + E + LH 2 E-LH 2 -AMP + PP E-LH 2 -AMP + O 2 OSSILUCIFERINA + AMP + CO 2 + LUCE E-LH2-AMP = complesso luciferinadenilato E = luciferasi LH 2 = luciferina AMP = adenosimonofosfato PP = pirofosfato RLU = Unità di luce relativa

12 Test dell ATP: procedimento 1. Allestimento del campione 2. Estrazione dell ATP 3. Reazione enzimatica campione + estraente + reattivo

13 Rilevazione presenza contaminanti microbiologici «metabolicamente attivi» (ad esempio, non adatto per spore, virus, parassiti) Semplice e rapido, poco costoso, test di prima linea Ridotti volumi di campione Elevata sensibilità Vantaggi Aspetti problematici - Strumentazione dedicata - rapida degradazione ATP - diversa quantità di ATP nelle cellule batteriche - interferenti: molecole organiche - necessario conoscere il «rumore di fondo» della matrice se si analizza il campione tal quale Caratteristiche del test dell ATP

14 Analisi batteriologiche: impiego di test rapidi nello screening per l emergenza (situazione fine 2005, per le Olimpiadi)

15 CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA INTENZIONALE: ESTRAZIONE DEL DNA BATTERICO PER L ANALISI BIOMOLECOLARE Filtrazione del campione (1L) su membrana in PC (0.45 mm) Sospensione in 10mL (concentrato batterico) Ultrafiltrazione (taglio Da) o purificazione su colonna (centrifugazione 2200g per 10 min) Recupero di 200 ml circa (concentrato batterico) Aggiunta di soluzione lisante (50 ml) Riscaldamento a 95 C (10 min) ultra-centrifugazione a 10000g per 1 min Recuperare il surnatante (DNA ESTRATTO, circa 150mL, 80% di campione) N.B. L analisi strumentale viene effettuata su 10 ml, corrispondenti a circa 83 ml di campione originale; il DNA ESTRATTO può essere conservato a -20 C per 6 mesi

CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA INTENZIONALE: VIRUS E PARASSITI Volume da analizzare: 100L per il monitoraggio, 5L per contaminazione intenzionale, per ciascun tipo di target Parassiti: (protozoi

16 CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA INTENZIONALE: VIRUS E PARASSITI Volume da analizzare: 100L per il monitoraggio, 5L per contaminazione intenzionale, per ciascun tipo di target Parassiti: (protozoi Giardia e Cryptosporidium): filtrazione da 1 a 5L di campione (su PC, 1 mm) e procedere secondo il metodo routinario Virus: prelevare almeno 5 L (recipienti in plastica); metodo biomolecolare (PCR) Pretrattamento: ultrafiltrazione (taglio Da) oppure filtrazione/concentrazione su membrana elettropositiva ed eluizione in volume ridotto; altrimenti conservare il campione a 5 C

BIBLIOGRAFIA Istituto Superiore di Sanità Rapporti ISTISAN 05/4 Sicurezza dei sistemi acquedottistici (2005) Department of Homeland Security Science and Technology PNNL-21713

17 BIBLIOGRAFIA Istituto Superiore di Sanità Rapporti ISTISAN 05/4 Sicurezza dei sistemi acquedottistici (2005) Department of Homeland Security Science and Technology PNNL Biodetection Technologies for First Responders (2012) S. States et al. Utility-based analytical methods to ensure Public water supply security - JAWWA (2003) Grazie per l attenzione!

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