Sviluppo di sistemi innovativi per i controlli di sicurezza e qualità delle acque ad uso ricreazionale Dott.ssa Valeriani Federica

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1 TITOLO TESI DI DOTTORATO Sviluppo di sistemi innovativi per i controlli di sicurezza e qualità delle acque ad uso ricreazionale Dott.ssa Valeriani Federica

2 Riassunto Negli ultimi due decenni un forte incremento dell'attività sportiva è stato osservato in molti paesi occidentali, compresa l'italia. L'evoluzione e la diffusione dell attività fisica pone importanti questioni di salute pubblica. Gli impianti sportivi indoor sono ambienti in cui la struttura e le condizioni microclimatiche possono influenzare la salute e il benessere degli utenti. In particolare le piscine sono luoghi in cui i potenziali benefici per la salute richiedono una corretta gestione e prevenzione dei rischi. Secondo le linee guida pubblicate dalla Organizzazione Mondiale della Sanità nel 2006, i principali rischi che si trovano in questi ambienti sono la contaminazione microbica, l'esposizione ad agenti chimici, fisici e fattori di rischio procedurali o comportamentali. Malattie ed epidemie, tra cui le infezioni cutanee e gastrointestinali, possono essere causate da patogeni opportunisti trasmessi attraverso l'acqua e le superfici contaminate. La sorveglianza attiva ed il monitoring sono strumenti essenziali per la tutela della salute, e diverse normative sono disponibili. Alcuni indicatori microbiologici definiscono i livelli di sicurezza delle acque di piscina. La ricerca di tali specie batteriche si esegue in genere con protocolli standardizzati, fondamentalmente basati su tecniche colturali. Questi metodi tradizionali richiedono procedure lunghe e articolate. I metodi molecolari costituiscono tecniche alternative che hanno il vantaggio di essere più rapidi, sensibili e specifiche rispetto ai metodi tradizionali. In tale contesto, e importante lo sviluppo di sistemi innovativi basati anche sulla proposta di nuovi metodi molecolari. Il presente lavoro di dottorato ha come obbiettivo il miglioramento di tecniche esistenti e lo sviluppo di protocolli innovativi per un gruppo selezionato di batteri riscontrabili come indicatori in acque di piscina. In primo luogo è stato effettuato un lavoro di revisione della letteratura seguito da una comparazione in laboratorio tra metodi. Un nuovo sistema in corso di sperimentazione per la identificazione di Pseudomonas aeruginosa, attraverso una reazione enzimatica, è stato confrontato con il metodo di riferimento UNI EN ISO I risultati e l analisi dei dati hanno mostrato che il tale metodo rapido Pseudalert Quanti-Try è risultato selettivo (-0,086), efficiente (98,4%), sensibile (98,8%) e specifico (96,8%), permettendo di ottenere i risultati in 24 ore. Seppur il protocollo di comparazione si fosse limitato all analisi di acque clorate, il sistema potrebbe rappresentare uno strumento utile e promettente per rilevare P. aeruginosa in campioni di acqua, in quanto permette di ottenere risultati comparabili al metodo di riferimento in tempi più brevi, consentendo di accelerare, qualora necessario, l intervento sanitario e le azioni preventive. Un altro tema importante in materia di controlli delle epidemie in ambienti di piscina, affrontato in questo studio, è stato lo sviluppo di

3 metodi rapidi alternativi per la rilevazione di Legionella spp. in strutture sportive. Tale aspetto è particolarmente rilevante per il monitoring della qualità delle acque e la prevenzione della Legionellosi. In particolare è stato sviluppato un lavoro volto a dimostrare l'applicabilità di un metodo molecolare quantitativo (qpcr) usato in combinazione con Ethidium monoazide (EMA) per la quantificazione di cellule vitali di Legionella spp. in campioni raccolti da piscine, sistemi di ricircolo dell'acqua e sistemi di acqua calda in centri sportivi. In questo studio attraverso qpcr convenzionale e EMA-qPCR sono risultati positivi a Legionella 11 dei 16 campioni (68,7 %), mentre nel restante 31,3%, Legionella era al di sotto del limite di rilevazione per queste tecniche molecolari (LOD=400 GU L-1). D'altra parte, con il metodo di coltura solo 3 su 11 (27,2 %) campioni sono risultati positivi. Nei campioni, risultati positivi con metodi molecolari, i valori EMA-qPCR erano più bassi di quelli rilevati con qpcr, a conferma che la qpcr può sovrastimare la quantità di Legionella potenzialmente infettiva. I risultati hanno confermato che EMA-qPCR permette di discriminare le cellule non vitali da quelle vitali e fornisce informazioni circa la presenza delle VBNC, ossia quelle cellule vitali ma non-coltivabili. La loro identificazione è molto importante in quanto seppur tali cellule non sono rilevabili attraverso metodi microbiologici, mantengono comunque il loro potere di virulenza, con rischi per la salute (Mansi et al., 2013). Inoltre, nel presente studio è stato sviluppato un protocollo per rilevare specie indicatori di contaminazione in acque di piscina, anche in basse concentrazioni. Il metodo è basato sul molecular enrichment un arricchimento molecolare articolato in due fasi di amplificazione del gene 23S rdna e finalizzato ad aumentare i livelli di sensibilità in modo proporzionale, nel rispetto di una analisi di tipo semiquantitativo: un primo step di PCR tradizionale con primer universali e un secondo step utilizzando Real Time PCR e primer e probe specifici per Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, P. aeruginosa, Escherichia coli. Al fine di valutare la sensibilità e limiti di linearità dell'approccio proposto, in un primo tempo diluizioni seriali di DNA genomico di S. aureus sono stati analizzati in triplicato, con e senza la fase di arricchimento molecolare. I risultati hanno mostrato un guadagno costante di sensibilità nel protocollo di arricchimento molecolare, quantificato in circa 7 C T, per reazione nel range 10 fg-10 pg di DNA stampo ed un coefficiente di correlazione prossimo a 1 (R 2 =0,99). Inoltre, il limite inferiore di rilevamento è stato di 10 fg di DNA, equivalente al contenuto genomico di 2-3 cellule di S. aureus. Al fine di verificare l'affidabilità del metodo su campioni ambientali, sei campioni d'acqua con un titolo di S. aureus da 10 1 a 10 3 ufc/ml sono stati analizzati in parallelo con il metodo microbiologico tradizionale, con Real-time PCR, in presenza ed assenza del passaggio di arricchimento. I risultati hanno confermato l'incremento della sensibilità dopo arricchimento molecolare e i dati ottenuti risultano comparabili con la quantificazione microbiologica. In un secondo momento, proprio alla luce dei risultati

4 ottenuti e di una possibile estensione del metodo anche ad altre specie batteriche indicatori, sono stati sviluppati altri protocolli molecolari. In particolare, con l ausilio della bioinformatica, sono stati progettati primer e sonde specifiche per E. coli, P. aeruginosa e E. faecalis. I primer sono stati utilizzati in reazioni di PCR con 0,5 ng di DNA stampo di ciascuno degli indicatori batterici selezionati, al fine di verificare l'assenza di cross-reattività. I risultati delle analisi eseguite con le varie coppie di primer, hanno dimostrato come per S. aureus, E. faecalis e P. aeruginosa sia possibile ottenere segnali di amplificazione specifici tra C T 17 e C T 26 e nessuna cross-reattività per altri DNA aspecifici. Invece, nel caso di E. coli, oltre a un attesa amplificazione a C T 24, è stata riscontrato anche un forte background intorno C T 33. La causa di questo fenomeno è stata attribuita a tracce di contaminante presenti nei reagenti commercialmente disponibili. Per ridurre al minimo tale problema è stata utilizzata con successo una Taq "nativa" (non ricombinante in E. coli). I risultati hanno mostrato l'assenza del background, ma anche una inferiore efficienza e sensibilità di rilevamento del sistema. Il successivo lavoro di ottimizzazione e l adozione di piccole modifiche nel protocollo hanno prodotto interessanti miglioramenti nei livelli di sensibilità. Al fine di testare la sensibilità e limiti di linearità dell'approccio proposto, diluizioni seriali in base 10 del DNA genomico di E. faecalis e P. aeruginosa sono stati analizzati in triplicato, con e senza la fase di arricchimento molecolare. I risultati con P. aeruginosa hanno mostrato un guadagno costante di sensibilità con il protocollo arricchimento molecolare, quantificato in circa 7 C T per reazione, nel range tra 8 fg e 8 pg di DNA. La serie di dati sono stati caratterizzati da un coefficiente di correlazione prossimo a 1 (R 2 = 0,99), con e senza arricchimento. Il limite inferiore di rilevamento è stato di 8 fg di DNA, equivalente al contenuto genomico di circa 1 cellula. I risultati con E. faecalis hanno mostrato un guadagno costante di sensibilità nel protocollo molecolare arricchimento, quantificati in circa 7 C T, per reazione nel range tra 5 fg e 50 pg di DNA stampo. L' insieme di dati sono stati caratterizzati da un coefficiente di correlazione prossimo a 1 (R 2 =0,99) in campioni analizzati dopo arricchimento (in assenza: R 2 = 0,94). Il limite inferiore di rilevamento per E. faecalis, è dunque di circa 5 fg di DNA, equivalente al contenuto genomico di 1 cellula (in assenza: circa 100 cellule). Il livello di sensibilità è in linea con le diverse leggi nazionali e linee guida, che richiedono il rilevamento di meno di 10 cellule per litro sia per E. faecalis che per P. aeruginosa. I risultati ottenuti da campioni di acqua di piscina, hanno confermato l'applicabilità del protocollo su campioni reali, un punto rilevante per una successiva attività di convalida (Valeriani et al., 2012; 2013).

5 Abstract In the last two decades an increase in sport activity has been reported in many western countries, including Italy. The evolution and diffusion of physical activity poses important issues for public health. Indoor sports facilities are environments where the structure and the microclimatic conditions may affect the health and wellness of athletes. In particular, potential benefits have to be balanced with acceptable risks for users. According to the guidelines published by World Health Organization in 2006, risks found in these environments can be classified in biological, chemical, physical and procedural or behavioral. Epidemiological data show that a variety of microorganisms, which may represent hazards, can be found in swimming pool waters and sport environments. Several outbreaks have been reported around the world, describing virus, bacteria or fungi as possible etiological agents. The surveillance and availability of effective monitoring tools is a key point for prevention in these contexts, and several specific national regulations have been adopted in different countries. In Italy, the main reference is the Accordo Stato-Regioni that was stipulated in 2003 and that indicates all the essential parameters for security of pools. In particular, it identifies four species of microbes that are used as indicators, in addition to the total microbial load analysis. The research for indicator species occurs generally with standardized methods, in particular based on microbiological techniques. These conventional methods require lengthy and articulated procedures. The molecular methods are alternative techniques, characterized by strong specificity and less time-consuming protocols. Many of these techniques are based on nucleic acids amplification by PCR (polymerase chain reaction), but other approaches are available e.g. based on immunological methods or cultural pre-enrichment. A main advantage related to the adoption of real time amplification protocols (RT-PCR) is that it allows a quantitative analysis, independently from culture condition requirements. The aim of the present research project is to improve existing techniques and develop innovative protocols for a selected group of bacteria present in pool waters; in particular, focusing on the indicator species, according to the Italian law. During the first year of this PhD, a deep bibliographic analysis has been performed to clarify the state of the art on technical tools in microbiological monitoring for recreational waters. In addition several fast assays have been tested with particular emphasis to the PCR and biochemical/enzymatic approach. Some tests were conducted on the species Pseudomonas aeruginosa, gram negative bacteria associated with otitis, dermatitis and conjunctivitis. To verify the feasibility of a new method for detection of P. aeruginosa in recreational waters, comparisons were conducted between the standard method UNI EN ISO and Pseudalert Quanti- Try, IDEXX. The results and analysis of the data showed that the method Pseudalert is sensitive and specific for Pseudomonas aeruginosa. This method appeared selective (-0.086), efficient (98.4%), sensitive (98.8%) and specific (96.8%), allowing results in 24 hours. This approach allows to obtain in shorter time results comparable to the official reference method, allowing to accelerate, if necessary, the

6 sanitation and/or prevention action. Moreover, two further different approaches were developed and implemented for the identification of bacteria in recreational waters. In order to demonstrate the applicability of a molecular method (qpcr), used in combination with Ethidium monoazide (EMA), for the quantification of Legionella spp., was developed a protocol and tested samples collected from several pools, water recirculation systems, SPA and hot water systems in sports and wellness centers. In our study, conventional qpcr and EMA qpcr detected Legionella spp. in 11 out of 16 (68.7%) samples. On the other hand, the culture method quantified only 3 out of 11 (27.2%) samples resulted positive by molecular methods. Furthermore, in these three samples positive by all methods, EMA qpcr values were between culture and qpcr counts, confirming that culture and qpcr can respectively under- and over- estimate the quantity of infectious legionellae. The results confirmed that EMA-qPCR can allow discrimination between non-viable cells respect to VNBC, viable but not cultivable cells (Mansi et al., 2013). Furthermore it was developed an innovative protocol based on a newly designed approach that we named molecular enrichment and that allowed the identification of low concentrations of bacteria in swimming pool waters and other aquatic environments (Valeriani et al., 2012). The new method developed is based on the specific amplification of prokaryotic genomic DNA by the design of universal primers for 23S rdna; subsequently, a second amplification step is performed with specifics real time PCR primers and probes designed on Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, P. aeruginosa, Escherichia coli ribosomal genes (Valeriani et al., 2013). In order to test sensitivity and linearity limits of the proposed approach, serial 10-fold dilutions of S. aureus genomic DNA were analyzed in triplicate, both with and without the molecular enrichment step. The results showed a constant gain of sensitivity in the molecular enrichment protocol, quantified in approximately 7 CT, for reaction starting from 10 fg 10 pg of template DNA and a correlation coefficient close to 1 (R 2 = 0.99). In order to verify the reliability of the method on environmental samples, six water samples with S. aureus titers ranging from 10 1 to 10 3 cfu/ml were assayed in parallel with the three methods: microbiological approach, real time PCR with and without enrichment. The results confirm the increment of sensitivity after molecular enrichment and the data obtained are comparable with the microbiological quantification. Subsequently, primers and probes are designed specifically for E. coli, P. aeruginosa and E. faecalis. Primers were tested in PCR reactions with 0.5 ng of template DNA from the selected bacteria indicators, in order to verify the absence of cross-reactivity. The results showed that primers for S. aureus, E. faecalis and P. aeruginosa have specific amplification signals between C T 17 and C T 26, while in the case of E. coli, in addition to an unequivocal amplification at C T 24 on the expected template, it is present a strong background around C T 33. To minimize this problem we used native Taq (not-recombinant in E. coli). Results showed the absence of the background but a low detection sensitivity of the system. In order to improve the limit of detection of the assay, new protocols are under development. Preliminary data showed an interesting improvement in sensitivity levels. In order to test sensitivity and linearity limits of the proposed

7 approach, serial 10-fold dilutions of E. faecalis and P. aeruginosa genomic DNA were analyzed in triplicate, both with and without the molecular. enrichment step. The results of P. aeruginosa genomes analysis showed a constant gain of sensitivity in the molecular enrichment protocol, quantified in approximately 7 C T, for reaction starting from 8 fg to 8 pg of template DNA (Fig. 3). The set of data was characterized by a correlation coefficient close to 1 (R2 = 0.99), both with and without enrichment. However, the lower limit of detection was of 8 fg of DNA, equivalent to the genomic contents of about 1 cells. The results of E. faecalis genomes analysis showed a constant gain of sensitivity in the molecular enrichment protocol, quantified in approximately 7 C T, for reaction starting from 5 fg to 50 pg of template DNA. The set of data was characterized by a correlation coefficient close to 1 (R 2 = 0.99) in samples with enrichment step (without enrichment step: R 2 = 0.94). The lower limit of detection with E. faecalis, through the molecular enrichment protocol, is 5 fg of DNA, equivalent to the genomic contents of 1 cell (not enriched sample: 100 cells). The level of sensitivity is in line with several national laws and guidelines that require detection of less than 10 cells for liter both for E. faecalis and for P. aeruginosa. Main goal of this PhD project was to compare molecular methods for surveillance of swimming pool water and improve/develop rapid, efficient and sensitive procedures for identification of basic hygiene indicators for pool water safety.