Università degli Studi di Firenze

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1 Università degli Studi di Firenze DIPARTIMENTO di SANITA PUBBLICA LEGIONELLA: Valutazione del rischio, proposte e soluzioni LEGIONELLA: CARATTERISTICHE del BATTERIO, ECOLOGIA e DIFFUSIONE nell AMBIENTALE ARTIFICIALE Dott.ssa Antonella Lo Nostro AREZZO, 25 MAGGIO 2012

2 Legionella spp. Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

3 LA STORIA Nel luglio 1976 a Philadelphia presso l hotel BELLEVUE-STRATFORD che ospitava la 58 Convention dell American Legion si verificò una grave epidemia di polmonite atipica : 221 soggetti con grave quadro clinico di polmonite atipica febbrile 34 morirono La malattia fu chiamata MALATTIA DEL LEGIONARIO L esame batteriologico evidenziò microrganismi mai identificati in precedenza. Nel 1978 al 1 Simposio Internazionale ad Atlanta al microrganismo fu dato il nome di: Legionella pneumophila ed il ceppo isolato a Philadelphia fu assunto come ceppo di riferimento. Le segnalazioni di casi sia sporadici che epidemici sono divenute sempre più frequenti

4 BELLEVUE-STRATFORD HOTEL A PHILADELPHIA (USA) luglio 1976 Alla 58 Convention della American Legion dei 4000 veterani membri della American Legion e chiamati Legionnaires : 221 si ammalarono e 34 di essi morirono di polmonite atipica da Legionella Inaugurato nel 1904

5 LA STORIA Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze In Italia la 1 notizia di un epidemia di Legionellosi risale al Luglio 1978 quando ricercatori danesi dettero notizia di 3 casi clinicamente confermati e di altri 7 riconducibili a Legionellosi in turisti danesi che avevano soggiornato sul Lago di Garda Epidemia di 23 casi di cui 2 ad esito letale in un albergo di Lido di Savio (RA) 1981 Casi in turisti inglesi che avevano soggiornato sulla riviera romagnola 1982 Il CDSC (Comunicable Disease Surveillance Center) di Londra notificò casi in turisti inglesi che avevano soggiornato in Italia nel periodo giugno luglio 1984 Presso l Ospedale delle Molinette di Torino si ha la più grande epidemia di Legionellosi insorta a seguito di acquisizione nosocomiale (18 casi) 1986 Paestum Negli ultimi anni ci sono stati numerosi 1987 Folgaria decessi in turisti che hanno soggiornato in 1990 Ischia alberghi della riviera romagnola 1992 Molveno 1997 Firenze

6 DAL 1976 LEGIONELLA ALLA RIBALTA OMS istituisce Sistemi speciali di Sorveglianza I.S.S istituisce il Registro Nazionale delle Legionellosi (1983) La Comunità Europea istituisce EWGLI (European Working Group of Legionella Infections) tra cui EWGLINET (1986) Prevenzione unica arma contro Legionella Nel 2000 emanate le Linee Guida (non obbligatorie) Stabiliscono i criteri per: campionamento ricerca del microrganismo trattamento e bonifica

7 Ma chi è Legionella?? Classificazione Famiglia: Legionellaceae Genere: Legionella Specie: Legionella pneumophila (16 sierogruppi) e altre 50 specie Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

8 50 specie di cui 20 responsabili di infezioni nell uomo 70 diversi sierogruppi Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

9 Famiglia: Legionellaceae genere Legionella 50 specie 70 sierogruppi (molti opportunisti) L.pneumophila di sierogruppo 1 e 6 maggiormente implicata nella patologia umana (85% dei casi), seguita da L.micdadei (10% circa dei casi), meno frequenti L.dumoffii, L.bozemanii, L.gormanii, L.anisa e L.longbeachae

10 Morfologia e struttura Forma: cocco-bacillare Gram negativi aerobi asporigeni mobili (uno o più flagelli), dotati di fimbrie Dimensioni: 0,3-0,9 µm di larghezza; 1,5-5 µm di lunghezza (in coltura frequenti forme filamentose, lunghe fino a 20 µm) Parete: presenza di acidi grassi a catena ramificata di solito non presenti nei batteri Gram-negativi Autofluorescenza (alcune specie) Chemoorganotrofi: non fermentano nè ossidano gli zuccheri, utilizzano AA come fonte di carbonio e di energia, crescita stimolata da ioni ferro

11 Legionella Habitat: ambiente acquatico naturale (laghi, fiumi, acque termali, fanghi, terreno umido) artificiale (acque condottate, impianti idraulici, umidificatori, acque di condensa di impianti di ventilazione/condizionamento, torri di raffreddamento, apparecchi sanitari, etc.) Simbiosi: batteri, alghe azzurre Parassitismo intracellulare: - free-living amoebae e altri protozoi - macrofagi e monociti La concentrazione di Legionella nell ambiente naturale è di solito bassa Veicolo di infezione: aerosol ( = 0.5 µm) prodotto da acqua contaminata.

12 Legionella sopravvive negli ambienti acquatici come parassita intracellulare di protozoi a vita libera La scoperta del ruolo dei protozoi (14 specie di amebe, tra cui Naegleria e Acanthamaebae, due specie di flagellati tra cui Tetrahymena ed una specie di muffa gelatinosa) come serbatoio per la moltiplicazione e la sopravvivenza delle legionelle ha permesso di comprendere l epidemiologia e l ecologia di questi batteri. A 20 C, i protozoi fagocitano le legionelle e le digeriscono in gran numero. A 35 C, le legionelle fagocitate si moltiplicano all interno dei protozoi.

13 Ciclo vitale di L. pneumophila Vita libera: batteri flagellati e mobili Aderenza alle cellule ospiti: protozoi o macrofagi Ingestione da parte della cellula ospite Perdita del flagello nel citoplasma Occupazione di un vacuolo e formazione di un unico fagosoma che non si fonde con il lisosoma Il fagosoma si trasforma in un comparto con reticolo simil-endoplasmatico Fase replicativa: i batteri non ciliati si moltiplicano nel reticolo simil-endoplasmatico del fagosoma Fase infettiva: il fagosoma si fonde con il lisosoma e libera batteri ciliati ed attivamente mobili La cellula ospite muore ( i protozoi per necrosi, i macrofagi e le cellule alveolari per apoptosi o per necrosi).

14 Ciclo vitale di Legionella all interno delle amebe Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze Dopo la fase esponeziale di crescita all interno dell ameba, non sempre abbiamo la lisi di quest ultima. Come particelle infettanti possiamo avere: Legionelle libere Amebe intatte piene di vescicole Vescicole piene del batterio Trasmissione all uomo tramite particelle infettanti Le amebe aumentano la potenziale trasmissione all uomo: Legionella aumenta di numero al loro interno Selezionano quei caratteri virulenti che porteranno all infezione dei macrofagi alveolari

15 RESISTENZA nell AMBIENTE Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze Legionella a vita libera poco resistente agli agenti fisici e chimici All interno dei protozoi, e soprattutto all interno delle cisti, sono molto resistenti agli aumenti di temperatura e ai biocidi Nell ambiente sopravvivono per molti mesi se sono all interno dei protozoi o associate nel BIOFILM nelle tubazioni Tollerante ampio range di condizioni chimico-fisiche: Temperatura: 0-63 C optimum a C) ph: 5-8,5 po 2 :0,2-15 ppm

16 BIOFILM Un è costituito da aggregati di batteri, protozoi e miceti che aderiscono a irregolarità delle pareti interne di condutture ed altre strutture a contatto con l acqua, formando delle stratificazioni che hanno l effetto di corrodere le pareti stesse, facilitando depositi ed incrostazioni che sporgono e tendono ad occludere le tubazioni

17 BIOFILM Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

18 BIOFILM La presenza del BIOFILM è essenziale per la colonizzazione da parte di LEGIONELLA che trova in esso i protozoi e amebe entro cui moltiplicarsi e svolgere il ciclo vitale I batteri presenti nel BIOFILM acquisiscono VANTAGGI ECOLOGICI: Disponibilità di nutrienti generati dall attività metabolica del biofilm Aumentata possibilità per il trasferimento di virulenza e resistenza Protezione dai trattamenti chimici e fisici INCREMENTA il potenziale di sopravvivenza RICRESCITA dei batteri DISTACCO di cellule

19 FLORA BATTERICA ACQUATICA e LEGIONELLA Interazioni favorenti lo sviluppo di Legionella, nel caso in cui questi fungono da nutrimento per i protozoi e per cui, indirettamente, favoriscono lo sviluppo della Legionella Interazioni limitanti lo sviluppo di Legionella, nel caso in cui la flora batterica acquatica produca sostanze batteriocine-simili (BLS) contro Legionella. (Guerrieri, Bondi et al. 2007). Pseudomonas fluorescens risulta avere il maggiore effetto negativo Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Pseudomonas putida, Aeromonas hydrophila e Stenotrophomonas maltophilia meno inibenti Acinetobacter lwoffii è risultato essere l'unico in grado di potenziare fortemente la formazione del biofilm. (Guerrieri, Bondi et al. 2008)

20 Ruolo della flora batterica acquatica nell ecologia microbica di L. pneumophila DIRETTE competizione e produzione di batteriocine Screening su 72 ceppi di Pseudomonadaceae: 64% PRODUTTORI di BATTERIOCINE attive contro L. pneumophila INTERAZIONI INDIRETTE interazioni con i protozoi Nei confronti dei batteri i protozoi possono: Fungere da nutrimento favorire le legionelle Parassitarli sfavorire le legionelle

21 Interferenza microbica e sviluppo di biofilm in vitro ufc/cm L.p. L.p. + Pseudomonas aeruginosa L.p. + Pseudomonas fluorescens L.p. + Acinetobacter lwoffii Tempo (giorni) P. aeruginosa produce PIOCINE ma non influisce su L.p. P. fluorescens produce una BATTERIOCINA e inibisce L.p. A. lwoffii non produce alcuna sostanza e promuove L.p.

22 VIRULENZA Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze - Presenza di fimbrie - Flagelli - Proteine associate alla virulenza PROTEINA MIP che potenzia l infettività ai macrofagi FLAGELLINA associata alla capacità di invadere le cellule ospiti PILINA associata alla capacità di aderenza alle cellule ospiti LEGIOLISINA svolge un attività emolitica PREPILINA PEPTIDASI necessaria per la moltiplicazione endocellulare Nel DNA sono stati isolati 3 loci chiamati enh1, enh2, enh3 che sono coinvolti nella capacità di penetrazione di Legionella pneumophila all interno di cellule ospiti. Uno dei geni presenti in enh1, il gene rtxa, è direttamente coinvolto nell aderenza, penetrazione e replicazione di legionella nei macrofagi umani. E presente in tutti i ceppi di Legionella pneumophila testate ed è correlato con le specie che causano malattie nell uomo.

23 Correlazione tra l attività trascrizionale di PMIP e replicazione intracellulare di Legionella Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

24 Modalità di contaminazione Poche cellule microbiche entrano negli impianti e si riproducono (20-45 C) RUOLO ESSENZIALE DELL ACQUA CALDA Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

25 FATTORI FAVORENTI la COLONIZZAZIONE degli Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze IMPIANTI IDRICI ARTIFICIALI temperatura dell acqua tra 20 e 50 C sedimenti ed incrostazioni calcaree, che rappresentano nicchie ecologiche a rapida colonizzazione (durezza dell acqua) tubi a fondo cieco, che favoriscono il ristagno di acqua in alcune zone dell'impianto; particolari materiali come plastica e pvc che rilasciano sostanza organica, possono facilitare la moltiplicazione di Legionella nel biofilm adeso alle pareti delle tubazioni torbidità, sostanze organiche, biofilm, Zn presenza di alghe e amebe acquatiche situazione climatica vibrazioni/cambiamenti di pressione nel sistema idrico

26 Fattori di rischio aggiuntivi nelle strutture turistiche Particolarità delle strutture turistiche - sistema di distribuzione dell acqua molto complesso (ogni stanza ha il bagno) con percorsi lunghi dal sito di distribuzione ai rubinetti - soggiorni brevi, variabilità nell uso in base alla stagione: - in alta stagione consumo di acqua concentrato in certe ore del giorno e notte (calo della T dell acqua) - in bassa stagione, scarso consumo o albergo chiuso con possibile ristagno che facilita la formazione di biofilm - la qualità dell acqua erogata può variare e dovrebbe essere monitorata più frequentemente - scarsa conoscenza del problema da parte del personale dei servizi tecnici dell hotel

27 AMBIENTE URBANO - Rete di distribuzione dell acqua -Sistemi di condizionamento e umidificatori (torri di raffreddamento/condensatori evaporativi) - Fontane decorative, impianti termali, vasche per idromassaggi, bagno turco e aree adibite a sauna, sistemi di irrigazione, acque di scarico di impianti igienici - Piscine e cisterne con acqua stagnante - Apparecchiature per inalazioni Gli ambienti idrici artificiali agiscono da amplificatori e disseminatori

28 HABITAT ANTROPICO Sono a rischio tutti gli impianti ed i processi tecnologici che comportano un moderato riscaldamento dell acqua e la sua nebulizzazione Le utenze e gli impianti più esposti a rischio sono: AMBIENTI COMUNITARI: edifici con torri di raffreddamento, caserme, carceri campeggi e strutture recettive in genere, impianti per attività sportive e scolastiche, stabilimenti termali, edifici con fontane decorative cascate artificiali. AMBIENTI NOSOCOMIALI: ospedali, cliniche, case di cura.

29 IMPIANTI TECNICI CRITICI condizionamento e umidificazione acqua calda soprattutto se in ricircolo torri e condensatori evaporativi idromassaggi fontane e cascate ornamentali impianti che generano aerosol bagni (apertura rubinetto o doccia) IMPIANTI E APPARECCHI MEDICALI o PARAMEDICALI CRITICI umidificatori dell ossigeno sondino naso-gastrico unità idriche odontoiatriche nebulizzatori apparecchi per cure pneumologiche apparecchi per cure termali inalatorie

30 Dai serbatoi naturali il batterio passa nei serbatoi artificiali rappresentati dall acqua condottata cittadina, impianti idrici dei singoli edifici, piscine, fontane, impianti di climatizzazione dell aria

31 ORIGINE DEI CASI I primi casi di legionellosi sono stati ricondotti ad aerosol provenienti da impianti di climatizzazione Le infezioni più recenti sono state causate da contaminazione di: impianti di distribuzione dell acqua (docce, rubinetti, fontane, impianti termali, idromassaggi) apparecchi per aerosol, ossigenoterapia e per la respirazione assistita Numerosi clusters epidemici vengono segnalati per la diffusione di aerosol contaminati da torri di raffreddamento di grandi edifici Segnalati casi acquisiti attraverso ferite Segnalato un caso in un neonato a seguito del parto in acqua

32 FATTORI DETERMINANTI per la TRASMISSIONE dell INFEZIONE SERBATOIO ARTIFICIALE CONTAMINATO rappresenta la prima condizione necessaria tale da consentire un significativo incremento della concentrazione del microrganismo MECCANISMI AMPLIFICANTI (ristagno, temperatura, nutrienti, biofilm, scorie, depositi, ecc.) EFFICACIA del MECCANISMO di DISSEMINAZIONE del PATOGENO attraverso la generazione di aerosol contaminato INALAZIONE di una DOSE MINIMA INFETTANTE Possono essere sufficienti 100 cellule per trasmettere l infezione ai soggetti appartenenti alla categoria classificabile come YOPI (Young, Old, Pregnant, Immunocompromised) ovvero individui in condizioni fisiche non ottimali (anziani, ospedalizzati, soggetti immunodepressi o affetti da patologie gravi)

33 FATTORI DI RISCHIO VIRULENZA DEL CEPPO: diversa capacità di sopravvivere e moltiplicarsi nei serbatoi ambientali ed umani (macrofagi) SUSCETTIBILITÀ DELL'OSPITE (età, sesso, abitudini di vita, patologie e/o terapie immunodefedanti) CONCENTRAZIONE DI LEGIONELLA NELL'AEROSOL : carica batterica, grado di aerosolizzazione dell acqua DISTANZA DALLA SORGENTE il rischio aumenta al diminuire della distanza!!! FREQUENZA E DURATA DELL'ESPOSIZIONE CONDIZIONI METEOROLOGICHE (umidità relativa, nebbia, inversione termica, vento)

34 FATTORI di RISCHIO INDIVIDUALI Età avanzata Sesso maschile Alcolismo Tabagismo Malattie croniche Trapianto d organo Stati di immunodeficienza Addetti alla manutenzione Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

35 Fattori di rischio per infezione Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze numero < Sesso M:F = 2-3:1 Età media =55 aa, il 60% dei pazienti ha più di 50 aa classi di età Rara nei bambini, poco frequente nei giovani adulti Il 40% dei soggetti ha patologie croniche concomitanti Femmine Maschi

36 MODALITÀ di INFEZIONE Per inalazione di aerosol contaminati Per aspirazione di acqua contaminata Per inalazione di particelle di polvere generate da terriccio umido Malattia non contagiosa di origine ambientale No trasmissione inter-umana La trasmissione interumana non è stata dimostrata Non si contrae bevendo acqua contaminata

37 MODALITÀ di INFEZIONE Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze Tutti questi processi avvengono sotto il controllo dei geni Dot/Icm, Rib e Mip che consentono di esprimere questi fattori di virulenza, propri di L.pneumophila. Legionella prende contatto e determina la formazione di un poro sulla membrana dei macrofagi Viene ingerita e forma una speciale vescicola fagosomiale Dopo la fase esponenziale forma dei pori di uscita I pori si trasferiscono sulla membrana plasmatica provocando la lisi del macrofago Amplificazione della risposta infiammatoria

38 NICCHIE ECOLOGICHE La patogenesi di Legionella è associata alla capacità d infettare le cellule fagocitarie umane. RETE IDRICA Rivestiti dal complemento e fagocitati Moltiplicazione nei macrofagi Rubinetti, miscelatori, docce I batteri raggiungono gli alveoli Malattia del Legionario: grave forma di polmonite atipica, con elevata letalità in pazienti anziani o immunodepressi. Diffusione per via ematica o linfatica ad altri organi Formazione aerosol Inalazione Febbre di Pontiac:sindrome pseudoinfluenzale con decorso benigno.

39 Malattie da Legionella Forme subcliniche Il frequente riscontro di anticorpi anti-legionella spp ( 15% nella popolazione generale) in assenza di episodi di polmonite fa ritenere che la Legionellosi si possa manifestare anche come forma subclinica Titolo diagramma Infezione Febbre di Pontiac Malattia dei Legionari

40 LA MALATTIA La POLMONITE da Legionella non ha caratteristiche cliniche che permettono di distinguerla da altre forme atipiche di polmonite Il danno organico è ricondotto a: Produzione di fattori tossici che danneggiano il parenchima polmonare Produzione di fattori della chemiotassi Liberazione di endotossine che attivano il fattore XII con formazione di essudato fibrinoso

41 Malattia dei Legionari incubazione 5-10 giorni concomitanti patologie nel 60% dei casi polmonite a esordio brusco mono o bilaterale, aspecifica con malessere, febbre, cefalea, osteoartralgie e tosse. manifestazioni extrapolmonari comuni: neurologiche confusione gastrointestinali nausea, vomito, diarrea renali proteinuria, ematuria

42 MANIFESTAZIONI EXTRAPOLMONARI COMUNI MANIFESTAZIONI EXTRAPOLMONARI RARE Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze Neurologiche: Confusione Disorientamento Letargia Gastrointestinali Nausea Vomito Feci non formate/diarrea Dolore addominale Renali Proteinuria Ematuria Testa/occhi/orecchi Nessuna Cardiache Nessuna Tessuti molli/pelle Nessuna Insonnia Allucinazioni Delirio Atassia Ascesso cerebrale Amnesia retrograda Convulsioni Neuropatia periferica Encefalomielite Vertigini Epatomegalia Peritonite Pancreatite Colite Insufficienza renale Insufficienza renale mioglobinurica Nefrite acuta tubulointerstiziale Ascesso renale Glomerulonefrite Miocardite Pericardite Effusione pericardica Torsione della punta Cellulite Ascesso cutaneo Infezione di ferite

43 Malattia dei Legionari comunitaria nosocomiale Tasso di letalità: Legionellosi comunitaria: 5-15% Legionellosi nosocomiale: 30-70% Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

44 MALATTIA dei LEGIONARI NOSOCOMIALE Fattori di rischio individuali: anestesia generale intubazione steroidi. Presenza reservoires : torri di raffreddamento umidificatori nebulizzatori acqua contaminata. Responsabile del 3-20% delle polmoniti nosocomiali: Secondo agente batterico causa di polmonite dopo lo Pneumococco Legionella pneumophila isolata nell'85% dei casi diagnosticati

45 Febbre di Pontiac incubazione ore simil influenzale risoluzione spontanea 2-5 gg SINTOMI: RX torace negativo malessere generale febbre tosse diarrea. Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

46 DIAGNOSI di LEGIONELLOSI Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

47 Alcune osservazioni L aumentata consapevolezza della malattia fra i medici e l uso dei test per la ricerca dell antigene urinario ha incrementato la individuazione dei casi sostenuti da L.pneumophila Il gold standard resta tuttavia l isolamento colturale che consente: a) di riconoscere tutte le infezioni b) di risalire alle fonti ambientali, attraverso l analisi molecolare dei ceppi clinici ed ambientali isolati

48 Università degli Studi di Firenze DIPARTIMENTO di SANITA PUBBLICA C.S.A. srl. Centro Servizi & Analisi LEGIONELLA: Valutazione del rischio, proposte e soluzioni EPIDEMIOLOGIA della LEGIONELLOSI in ITALIA e in EUROPA Dott.ssa Antonella Lo Nostro AREZZO, 25 MAGGIO 2012

49 Caso accertato infezione respiratoria con E.O. positivo per polmonite focale e/o esame radiologico suggestivo di interessamento polmonare, accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri: isolamento di Legionella da materiale organico (secrezioni, tessuto polmonare, liquido pleurico o sangue) aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale verso L. pneumophila sierogruppo 1 tra 2 sieri prelevati a distanza di almeno 10 giorni riconoscimento dell antigene antigene specifico solubile nelle urine

50 Sorveglianza della Legionellosi Notifica obbligatoria Classe II Classe IV (focolai epidemici) Sorveglianza speciale nazionale Sorveglianza europea della Legionellosi associata ai viaggi (EWGLI) Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

51 Legionellosi: notifica obbligatoria (CLASSE II e IV) CASO ISOLATO Al sospetto: entro 48 ore INVIO MENSILE Min. Salute medico ASL (SISP) Regione (SSEPI) ISS ISTAT FOCOLAIO EPIDEMICO: Entro 24 ore INVIO MENSILE tramite Sistema Informatizzato (entro il 15 del mese successivo)

52 STATI UNITI (50 Stati e Washington DC.) : 365 casi (molto inferiore alla reale incidenza stimata intorno a casi/anno) : casi/ anno. Il n. di casi annuale di Legionellosi è triplicato passando da nel 2000 a nel TASSO GREZZO di incidenza è aumentato del 192% (nel / ab. e nel / ab.)? Maggiore attenzione al problema Aumento dei soggetti a rischio (anziani,immunodepressi) Aumento di diagnosi e di notifica (Dati CDC Atlanta, 2011 )

53 Stagionalità fonte: CDC, USA Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

54 EUROPA: Tasso d infezione in Europa è passato da 4,1 casi/mil di abitanti nel 1993 a 10,1 casi/mil abitanti nel casi/mil abitanti nel 2008 Si ritiene: malattia ancora sottostimata incidenza superiore ai 20 casi /mil. di abitanti L.pneumophila sg 1 è stata responsabile del 76,5% dei casi totali riscontrati in Europa dal 2000 al 2002 Gli altri sieroruppi di L.pneumophila hanno causato il 17% dei casi, i rimanenti sono attribuibili altre specie

55 EUROPA : Casi di Legionellosi e tasso di incidenza per ab., (n=53,494) Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

56 EUROPA: casi di Legionellosi e tassi standardizzati su ab. per gruppi di età ( ) Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

57 EUROPA: numero e percentuale di casi di Legionellosi per LUOGO DI INFEZIONE (n=11.867) Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

58 EUROPA: EPIDEMIE di Legionellosi e CASI associati ai VIAGGI per categorie di infezione Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

59 Distribuzione percentuale delle varie sorgenti di infezione delle epidemie nosocomiali in Europa nel biennio Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

60 CASI CONFERMATI E TASSO DI NOTIFICA DI LEGIONELLOSI in EU ( ) Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

61 ITALIA Legionellosi: incidenza/ di abitanti per regione nel periodo Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

62 I CASI Casi di Legionellosi notificati per regione - L 76% dei casi viene notificato da 6 Regioni. Lombardia Piemonte Veneto Emilia-Romagna Toscana Lazio Il 24% notificato da 14 Regioni - Le regioni del Sud Italia inviano poche schede di sorveglianza ad eccezione della Puglia LA REGIONE MOLISE NON HA MAI NOTIFICATO ALCUN CASO DI LEGIONELLOSI

63 ITALIA : CASI di LEGIONELLOSI dal 2000 al 2010 Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze casi Legionellosi Italia anno schede notifica casi confermati CAUSE del TREND POSITIVO : Modifica nello stile di vita Maggiore attenzione al problema Linee Guida Test dell antigene urinario schede notifica casi confermati Lineare (casi confermati) Dai rapporti annuali sulla Legionellosi redatti dall ISS emerge : LA LEGIONELLOSI IN ITALIA è IN CONTINUO AUMENTO

64 I CASI - Incremento significativo dal 2001: Perché? : Linee Guida marzo 2000 Adozione del test per la ricerca di Legionella pneumophila nelle urine come test di routine Aumento della sensibilità negli operatori sanitari e nell opinione pubblica Aumento dei casi nel 2005 (+44.4%) che confermano il trend del numero dei casi a livello europeo

65 Casi di LEGIONELLOSI di origine comunitaria notificati per mese di inizio dei sintomi nel triennio STAGIONALITÀ:nel 2008 picco incidenza mese di agosto nel 2010 nel mese di settembre. Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

66 DISTRIBUZIONE PERCENTUALE dei CASI per OCCUPAZIONE 15% 2% pensionati 6% operai 6% 56% impiegati casalinghe professionisti altre caregorie 15% Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

67 ESPOSIZIONE A RISCHIO NEI 10 GIORNI PRECEDENTI (1.234 CASI) 5,3% 10,5% 3,4 ricovero 1,5% 0,%5 pernottamento fuori casa comunità chiusa piscine 78% cure odontoiatriche non noto Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

68 I CASI - La maggior parte di coloro che contraggono la malattia hanno superato i 50 anni di età - La categoria occupazionale più rappresentata è quella dei pensionati - Il sesso maschile è il più colpito in un rapporto di 2,5:1 29% 71% maschi femmine

69 Definizione di CASO NOSOCOMIALE Caso confermato da test di laboratorio, in cui il paziente è stato ricoverato continuativamente in ospedale per almeno 10 giorni prima dell esordio della malattia Se il periodo di ospedalizzazione è compreso fra 2 e 9 giorni, il caso è considerato di possibile eziologia nosocomiale Se 2 o più casi si verificano nello stesso ospedale nell arco di 6 mesi, vengono considerati una EPIDEMIA OSPEDALIERA Linee Guida nazionali

70 2010: CASI NOSOCOMIALI NOTIFICATI per REGIONE (n:65) Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze n. casi

71 LETALITÀ (%) dei CASI RIPORTATI Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

72 2010:CASI DI LEGIONELLOSI per METODO di DIAGNOSI La ricerca dell antigene urinario non è in grado di riconoscere anche l antigene di alcuni sierogruppi non-1 di L. pneumophila e quindi una positività all antigene urinario non identifica necessariamente un infezione da L. pneumophila sierogruppo 1

73 2010: NUMERO di CASI per FASCIA di ETÀ e per ESPOSIZIONE < non nota n. casi nosocomiali n. casi comunitari

74 3 ANNI di SORVEGLIANZA in TOSCANA Dal settembre 2002 a settembre 2005 abbiamo analizzato 302 campioni di matrice idrica distribuiti per le seguenti tipologie di struttura Strutture n.strutture n. campioni Ospedali 1 46 Case di cura Alberghi 8 21 Industrie 3 67 Totale

75

76 5 casi La distribuzione delle specie di Legionella nelle strutture sanitarie dislocate nell area fiorentina mostra una prevalenza di L. pneumophila sg 1 e 6 Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

77 5casi Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

78 % ANNI di SORVEGLIANZA in TOSCANA 0 36,7 67,1 23,8 hotel ospedali case di riposo 33,1 31,7 industrie terme % di campioni risultati contaminati da Legionella spp nelle strutture in esame ( A. Lo Nostro*, E. Checchi, B. Ducci, G. Pesavento. Legionella contamination in hot water of hospitals, nursing homes, hotels, factories and spas in Tuscany-Italy. IJPH - Year 9, Volume 8, Number 1, 2011)

79 100% 80% 60% 40% 20% 0% Hotels Hospitals Nursing Homes Factories Thermal springs L. spp L. dumoffii L. bozemanii L. micdadei L. pn. sg. 7/14 L. pn. sg.6 L. pn. sg.5 L. pn. sg.4 L. pn. sg.3 L. pn. sg.2 L. pn. sg. 1 Percentuale dei diversi sierogruppi di Legionella pneumophila ed altre specie isolate dalle strutture monitorate ( A. Lo Nostro*, E. Checchi, B. Ducci, G. Pesavento. Legionella contamination in hot water of hospitals, nursing homes, hotels, factories and spas in Tuscany-Italy. IJPH - Year 9, Volume 8, Number 1, 2011)

80 LEGIONELLOSI ASSOCIATA ai VIAGGI I dati europei confermano che la Legionellosi associata ai viaggi costituisce fino al 50% dei casi notificati in molti Paesi Nel 2009, per l elevato numero di cluster notificati, l Italia si colloca al I posto tra i Paesi europei per numero di cluster associati al soggiorno presso strutture recettive.

81 Definizione di caso di Malattia dei Legionari associata a viaggi EVIDENZA clinica o radiografica di polmonite DIAGNOSI di laboratorio confermata (coltura, sieroconversione o rilevazione dell antigene urinario) o presunta (sierologia o immunofluorescenza diretta Il paziente deve aver trascorso almeno una notte lontano da casa nel Paese di residenza o all estero nei dieci giorni precedenti l inizio della malattia. L inizio dei sintomi deve verificarsi entro 10 giorni dall ultimo giorno del viaggio.

82 EWGLI EUROPEAN WORKING GROUP FOR LEGIONELLA Sistema di sorveglianza europeo costituito nel 1986 Aderiscono a tale programma 38 Paesi Nel 2003 ha pubblicato le Linee Guida per facilitare la risposta e la gestione della malattia Dall entrata in vigore delle Linee Guida sono state identificate 70 epidemie di Legionellosi in zone turistiche d Europa

83 EUROPEAN WORKING GROUP for LEGIONELLA INFECTIONS (EWGLINET) Qual è l obiettivo? Raccogliere informazioni sui casi di Malattia dei Legionari che si verificano nei viaggiatori in modo da poter identificare le strutture recettive associate con uno o più casi e informare le autorità competenti del Paese. Chi partecipa? 38 Paesi di cui 17 EU

84 EUROPEAN LEGIONNAIRES' DISEASE SURVEILLANCE NETWORK (ELDSNet) ha sostituito EWGLINET ELDSNet è costituito da epidemiologi e microbiologi ELDSNet è costituito da epidemiologi e microbiologi di 27 paesi dell Unione Europea (EU) dall Islanda e dalla Norvegia che sono stati nominati a livello Europeo per la sorveglianza della Malattia del Legionario dalle rispettive strutture governative.

85 : Casi di Legionellosi associata ai viaggi in Europa Source: EWGLINET Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

86 Le informazioni relative ai pazienti stranieri che hanno probabilmente acquisito l'infezione in Italia sono state fornite fino al 30 marzo 2010 dal programma di sorveglianza europeo Ewglinet coordinato dal Communicable Disease Surveillance Centre (CDSC) dell Health Protection Agency (HPA) di Londra. Dal 1 aprile 2010 aprile 2010 il programma è stato trasferito a Stoccolma e viene coordinato e gestito dall ECDC ed ha preso il nome di ELDSnet (European Legionnaires Disease Surveillance network).

87 Nel 2010 sono stati notificati all ISS 232 casi di legionellosi associata ai viaggi (turisti italiani + stranieri) I casi in turisti italiani sono stati complessivamente 129, di cui il 93% avevano soggiornato in albergo, il 4% in campeggio e il restante 3% presso altre strutture recettive. La maggioranza dei turisti italiani ha viaggiato in Italia e solo nel 10% dei casi la meta del viaggio è stata una località straniera. I casi di legionellosi verificatisi in turisti stranieri che hanno visitato l Italia e notificati all ISS dall'eldsnet sono stati complessivamente 103 L età media dei turisti (italiani + stranieri) è di 64 anni (range anni) Le Regioni più frequentemente visitate dai casi di legionellosi associata ai viaggi sono state Lombardia (15%), Emilia-Romagna (13%), Veneto (12%), Toscana (10%) Campania (8%).

88 ITALIA : 2010: CASI di LEGIONELLOSI in TURISTI STRANIERI per PAESE di PROVENIENZA Totale Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze n. di casi in turisti

89 Sorveglianza europea della Legionellosi associata ai viaggi schema generale Presunta acquisizione in Italia SISP della ASL di competenza Centro collaboratore del Paese di diagnosi dei casi presumibilmente associati ai viaggi Centro coordinatore di Londra Istituto Superiore di Sanità risultati delle indagini Ministero della Salute Regione (SSEPI)

90 Sorveglianza europea della Legionellosi associata ai viaggi PROCEDURE Per i casi singoli è previsto il contatto della struttura e l invio alla struttura ricettiva di una check-list con indicazioni per la riduzione del rischio Per i cluster (2 o più casi) la procedura prevede lo svolgimento di un indagine e interventi per la riduzione del rischio. E previsto l invio di un rapporto preliminare (entro 2 settimane) e di un completo (entro 6 settimane). In caso di rapporti incompleti o assenti, le generalità della struttura ricettiva saranno pubblicate sul sito web di EGWLI, sino alla ricezione di un rapporto idoneo

91 The table below was last updated on 14 May 2008 Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze SITE NAME Hotel Punta del Sole Hotel Felix LOCATION Ischia, Campania ITALY NUMBER OF CASES ONSET OF MOST RECENT CASE 2 08/01/2008 ITALY 4 12/11/2007 Berr Hotel TURKEY 2 30/09/2007 Grand Hotel de Rose Scalea, Calabria, ITALY 3 17/09/2005 REASON FOR PUBLICATION The Form B has not been received for this accommodation site, and its status is uncertain. The Form B has not been received for this accommodation site, and its status is uncertain. The Form A has not been received for this accommodation site, and its status is uncertain. It is not known whether adequate control measures to prevent the spread of legionella are currently in place at this hotel.

92 ASPETTI CRITICI della LEGIONELLOSI Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze A) difficoltà nella identificazione dei casi e nella ricerca delle fonti ambientali B) insufficiente conoscenza sulla reale prevalenza della infezione/malattia C) poche informazioni sui fattori di rischio coinvolti nella infezione/malattia. D) limitate conoscenze sugli eventi molecolari e biochimici che permettono la sopravvivenza/moltiplicazione di Legionella nelle cellule umane e nei reservoirs ambientali E) difficoltà a controllare/eradicareeradicare Legionella spp applicando metodi di disinfezione efficaci

93 Motivi di preoccupazione Aumento nella popolazione delle persone a rischio Aumento negli ospedali di pazienti sottoposti a procedure a rischio Difficoltà ad eradicare Legionella dai serbatoi contaminati Mancanza di metodi ottimali per prevenire la Legionellosi

94 Università degli Studi di Firenze DIPARTIMENTO di SANITA PUBBLICA LEGIONELLA: Valutazione del rischio, proposte e soluzioni PIANO di CAMPIONAMENTO e MONITORAGGIO AMBIENTALE: QUANDO SERVONO e quali INFORMAZIONI FORNISCONO Dott.ssa Antonella Lo Nostro AREZZO, 25 MAGGIO 2012

95 Sorveglianza ambientale necessaria negli ambienti a rischio PREVENZIONE Tre livelli complementari: sorveglianza dei casi sorveglianza ambientale misure di bonifica Programmare la bonifica degli impianti e la successiva verifica

96 CONTROLLO della CONTAMINAZIONE del SISTEMA IDRICO Ricerca della Legionella nell'impianto idrico Metodi Quando? Commenti Nelle strutture recettive: in presenza di 1 o più casi In ospedale: monitoraggio periodico nei reparti ad alto rischio Rischio elevato di infezioni nosocomiali nel caso in cui la concentrazione di legionelle sia > 10 3 UFC/L Linee Guida per la prevenzione ed il controllo della Legionellosi (Gazzetta Ufficiale n. 103)

97 MONITORAGGIO E utile implementare un indagine ambientale ed eseguire campionamenti per ricerca di Legionella anche in assenza di casi? E un falso problema. Qualsiasi indagine microbiologica è di tipo retrospettivo, non risolve il problema, ma informa solo che c è un problema. Il monitoraggio è utile quando si vuole verificare: - l origine di una infezione, - le potenziali fonti di proliferazione / trasmissione, - l efficacia di un protocollo di bonifica. Il monitoraggio è utile quando si vuole tutelare, in ambiente ospedaliero, i pazienti a rischio.

98 INDAGINE AMBIENTALE Prerequisito dell indagine è una dettagliata conoscenza dell impianto idrico facendosi coadiuvare o dall idraulico in caso di un impianto semplice o da altro personale qualificato (ingegnere o geometri dei servizi tecnici) in caso di strutture più complesse. E importante ottenere un diagramma schematico dell impianto e annotare le seguenti particolarità: 1) la localizzazione della conduttura principale di rifornimento dell acqua o della sorgente privata, 2) La localizzazione delle cisterne, dei vasi di amplificazione o delle pompe, 3) La localizzazione dei caloriferi e dei riscaldatori d acqua, 4) il tipo di apparecchi usati nel sistema (rubinetti, docce, valvole) e con quale materiale sono state costruite le tubazioni, 5) la presenza di torri di raffreddamento, 6) presenza all interno dell edificio un sistema di aria condizionata ed uno di umidificazione.

99 SISTEMI di RISCALDAMENTO dell ACQUA CONTAMINAZIONE DEL SISTEMA IDRICO CONDENSATORI di EVAPORAZIONE RUBINETTI ACQUA CALDA e FREDDA (DOCCE) FONTANE SERBATOI VASCHE E PISCINE APP. per TERAPIE RESPIRATORIE

100 I siti da campionare Fredda * Serbatoio acqua (alla base) * Il punto più distale dal serbatoio Calda * Serbatoio acqua (alla base) * Ricircolo acqua calda * Almeno due siti erogazione (doccerubinetti) distanti dal serbatoio

101 DOVE ESEGUIRE i CAMPIONI e QUALI La ricerca di Legionella spp nell ambiente idrico artificiale,in funzione dell indagine eseguita, prevede la raccolta di campioni di acqua, di residuo di calcare, di biofilm, di filtri o di limo presente nei punti critici individuati: all inizio della rete, dalle cisterne e dagli scambiatori di calore, in uno sbocco prossimo, ma a valle di ciascuna cisterna o scambiatori di calore, in un punto distale di ciascun servizio, dall impianto di condizionamento (acqua di condensa e/o acqua di sgocciolamento e/o filtri). nelle torri di raffreddamento (acqua di sgocciolamento sul fondo della vasca)

102 CAMPIONAMENTO Nelle LINEE GUIDA EUROPEE per il controllo della LEGIONELLOSI NEI VIAGGIATORI, se in una struttura recettiva si evidenzia la presenza di un potenziale rischio, è necessario effettuare un campionamento dell acqua per la ricerca di Legionella spp. in un numero di siti che sia rappresentativo di tutto l impianto idrico e comunque non inferiore a 6. Rete dell acqua fredda: serbatoio dell acqua (possibilmente dalla base), il punto più distale dal serbatoio. Rete dell acqua calda: a) serbatoio di accumulo dell acqua calda alla base del serbatoio dell acqua calda vicino alle valvole di scarico, b) ricircolo dell acqua calda al sito di erogazione più distale dal serbatoio dell acqua calda.

103 Modalità di prelievo Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze Acqua Il volume consigliabile è di almeno 1 litro, quando possibile. L'acqua viene raccolta in recipienti sterili. Nel caso essa contenga cloro, é opportuno aggiungere sodio tiosolfato ad una concentrazione finale di 0,01% Depositi Prelievo dallo scarico, oppure dal fondo della raccolta di acqua, dopo aver eliminato l'acqua dall'alto. Incrostazioni Prelievo da tubature e serbatoi, staccando meccanicamente il materiale depositatosi all'interno. Con un tampone sterile si raccoglie il materiale depositato sulle superfici interne. Si conserva il tampone in recipiente (provetta) con tappo a vite, contenente una piccola (2 ml) quantità dell'acqua dell'impianto. Filtri Il controllo deve essere eseguito su filtri utilizzati da diverso tempo e non su quelli lavati o sostituiti di recente. Si preleva il filtro e si conserva in un sacchetto di materiale plastico.

104 CAMPIONAMENTO Volume di acqua da prelevare: almeno un litro in bottiglie sterili, ma in alcuni casi, in funzione della sensibilità della risposta quantitativa, fino a 5 litri. Modalità di prelievo: Prelievo di acqua per ricerca di Legionella 1) Per valutare, la presenza di Legionella, alle condizioni di utilizzo prelevare acqua calda senza farla scorre e non flambare il punto di sbocco. 2) Per valutare la presenza di Legionella, all interno della rete di distribuzione dell acqua, prelevare facendola scorre per 5-10 minuti e flambare il punto di sbocco. Trasporto: a temperatura ambiente ed al riparo dalla luce con consegna al Laboratorio entro 24 ore dal prelievo, a 4 C per un periodo non superiore a 7 giorni.

105 Università degli Studi di Firenze DIPARTIMENTO di SANITA PUBBLICA LEGIONELLA: Valutazione del rischio, proposte e soluzioni LE ANALISI di LABORATORIO: Interpretazione degli esiti analitici Dott.ssa Antonella Lo Nostro AREZZO, 25 MAGGIO 2012 Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

106 Linee Guida per la Prevenzione ed il Controllo della Legionellosi (G.U. n.103 del 5 maggio 2000) Riduzione del livello di contaminazione entro limiti di accettabilità. Criteri per: Modalità di campionamento per le diverse tipologie di impianto Metodiche ufficiali per la ricerca del microrganismo Modalità di trattamento e bonifica degli impianti e delle acque in uso In relazione alle cariche di Legionella rilevate: <10 2 UFC/l non è previsto alcun intervento sugli impianti, di norma assenza di casi UFC/l prevedere interventi di bonifica poiché esiste la possibilità che si realizzino casi sporadici >10 4 UFC/l contaminazione massiccia, attuare immediata decontaminazione con successiva verifica per possibile rischio epidemico.

107 IL RUOLO DEL LABORATORIO Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze Nella legionellosi il ruolo del laboratorio e importante non solo per la diagnosi eziologica dei casi ma soprattutto per delineare il percorso seguito dal microrganismo per raggiungere l ospite recettivo.

108 CARATTERISTICHE DI CRESCITA Temperatura di crescita Legionella si moltiplica tra 25 C e 42 C con temperatura ottimale di 35 C ph di crescita Il ph ottimale di crescita è leggermente acido ( tra 6,85 e 6,95 ), ma è tollerato un ph sino a 5,5 Respirazione Sono batteri aerobi, ma la loro crescita in terreni artificiali è favorita dalla microaerofilia soprattutto nel primo isolamento

109 ESIGENZE NUTRITIVE Per la loro moltiplicazione in terreni sintetici richiedono vari fattori di crescita: ferro organico, L- cisteina e fattori presenti nell estratto di lievito Richiedono terreni specifici di arricchimento come il BCYE: carbone attivo, estratto di lievito,l-cisteina HCl, pirofosfato ferrico, α cheto glutarato, ph : 6,9

110 PROTOCOLLO ANALITICO ACQUA Concentrare mediante filtrazione per membrana con porosità 0,2 µm. Prelevare la membrane con pinzette sterili e deporle in un contenitore sterile con tappo a vite contenente 10 ml della stessa acqua. Risospendere quanto depositato sulla membrana aiutandosi con una bacchetta a punta arrotondata oppure agitando energicamente su vortex. Trattare la sospensione a 50 C per 30 minuti. Piastrare 0,1 ml dei campioni trattati e non trattati su una/due piastre di terreno selettivo per Legionella. Incubare a C in aerobiosi, in ambiente umido, con 2,5% di CO 2, oppure in Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze microaerofilia. Conservare il campione concentrato a 4 C. Esaminare giornalmente le piastre. Qualora il campione fosse molto contaminato (presenza di numerose colonie dopo ore dalla semina), sarà necessario eseguire diluizioni in base 10 (10-1 e 10-2 ) con acqua distillata sterile del campione concentrato, eseguire un trattamento come indicato in precedenza e piastrare 0,1 ml su terreno selettivo. Eliminare una piastra come negativa solo dopo almeno 10 giorni di incubazione. Nel caso di presenza di colonie di Legionella si potrà effettuare una valutazione quantitativa (unità formanti colonia/litro, UFC/L) in base al numero di colonie per piastra ed alla concentrazione effettuata sul campione originale, tenendo conto anche delle eventuali diluizioni effettuate successivamente.

111 PROTOCOLLO ANALITICO DEPOSITI Effettuare diluizioni in base 10 (10-1 e 10-2 ) con acqua distillata sterile e agitare bene. Trattare le sospensioni come descritto precedentemente. Piastrare su terreno selettivo solo le sospensioni trattate. INCROSTAZIONI Frantumare e triturare le incrostazioni in mortaio o mixer sterili. Risospendere in acqua distillata sterile. Procedere come descritto al punto precedente. Piastrare su terreno selettivo il campione indiluito e diluito, senza e con trattamento. TAMPONI Agitare il tampone nella provetta per rimuovere il materiale raccolto. Trattare parte del campione come descritto in precedenza. Piastrare su terreno selettivo sia le sospensioni non trattate che quelle trattate. FILTRI Lavare il filtro o parte di esso in acqua distillata sterile e procedere come sopra descritto.

112 RICERCA COLTURALE di LEGIONELLA Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze Campione: 1 litro Filtrazione (0,2 µm) Risospensione in 10 ml Contenitore Trattamento Termico a 50 C per 30 min A 37 C in atm arr. 3-4 gg. Stipiti + BCYE - CYE Isolamento colonie sospette su BCYE e CYE Semina di 0,5 ml su BCYE,MWY Test Id. Sierolog. Incubati a 37 C in atm arricchita (2,5% di CO 2 ) per 7 gg

113 Su terreni selettivi come MWY contenente antibiotici e coloranti assumono colorazioni da verde a grigio/melanzana Le colonie mostrano notevole pleomorfismo: da puntiformi fino a 3-4 mm (forma circolare, parte centrale bianca e luminosa leggermente convessa di consistenza mucosa)

114 1. COLTURA Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze ISOLAMENTO di LEGIONELLA spp. Le colonie di Legionella si presentano piccole, di colore bianco-grigio, leggermente convesse, con bordi "a vetro smerigliato" se osservate con luce laterale. Compaiono dopo un periodo da 4 a 10 giorni di incubazione. Su terreno contenente coloranti (MWY) alcune specie possono assumere una colorazione caratteristica secondo la specie stessa. 2. PROVA DIFFERENZIALE PRELIMINARE Passare ogni colonia sospetta sia su BCYE agar (terreno completo di supplemento di crescita), sia su CYE agar base (terreno privo di supplemento di crescita). Incubare a 37 C per 48 ore. Le colonie di Legionella presenteranno crescita sul terreno completo ed assenza di crescita sul terreno base, per l'incapacità di Legionella di moltiplicarsi in assenza di cisteina e parzialmente anche di ferro. 3. IDENTIFICAZIONE Le prove biochimiche possono aiutare solo relativamente l'identificazione. Legionella non fermenta gli zuccheri e solo alcune prove enzimatiche sono presenti in una o più specie. Se osservate sotto raggi UV a lunghezza d'onda di 366 nm, alcune specie mostrano un autofluorescenza bianco-blu oppure rossastra. La tipizzazione si farà su base antigenica con prove sierologiche quali agglutinazione al lattice, immunofluorescenza diretta o indiretta, (Reagenti disponibili in commercio). Una subtipizzazione molecolare, sia antigenica che genomica, sarà utile per un confronto di stipiti di origine clinica ed ambientale.

115 ESAME COLTURALE (gold-standard): sempre allestito, per definire la sorgente dell epidemia e nel caso di infezioni da Legionelle diverse da L. pneumophila sierogruppo 1 Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

116 CLASSE A Livelli di contaminazione soglia nell acqua calda sanitaria e criteri di scelta LIVELLO DI CONTAMINAZIONE 10 4 UFC/L B UFC/L C UFC/L D < 10 2 UFC/L CRITERIO di SCELTA Contaminazione importante, mettere in atto immediatamente misure di decontaminazione. Contaminazione, si potrebbero verificare dei casi sporadici In assenza di casi è raccomandata aumentata sorveglianza clinica, in particolare nei pazienti a rischio In presenza di un caso effettuare la bonifica e adottare misure specifiche di prevenzione Bassa contaminazione ma probabillità che si verifichi 1 caso all anno. E raccomandata la sorveglianza In assenza di casi non è necessario alcun trattamento

117 VALUTAZIONE del RISCHIO e INTERVENTI di BONIFICA MISURE A BREVE TERMINE MISURE A LUNGO TERMINE Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze

118 MISURE A BREVE TERMINE: CONTROLLI AMBIENTALI - Immediatamente dopo la bonifica - se il risultato è negativo, dopo gg. - se negativo, dopo tre mesi - se negativo, periodicamente ogni sei mesi Antonella Lo Nostro - Dipartimento di Sanità Pubblica Università degli Studi di Firenze