Nuove tecnologie della riproduzione

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1 Nuove tecnologie della riproduzione Cesare Galli e Giovanna Lazzari Laboratorio di Tecnologie della Riproduzione, CIZ srl, Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani Via Porcellasco 7f, Cremona Italia La riproduzione riveste un ruolo fondamentale nell allevamento animale poiché, oltre che a moltiplicare gli animali da allevare, è anche lo strumento principale su cui si fonda il miglioramento genetico e la selezione. La fecondazione artificiale ha avuto ed ha tuttora l'impatto maggiore sull'allevamento bovino permettendo l'utilizzo di pochi riproduttori, geneticamente superiori, su gran parte degli animali allevati mentre la selezione sulla linea germinale femminile è limitata all'utilizzo del MOET (multiple ovulation and embryo transfer). Le nuove tecniche di riproduzione assistita consentono di aumentare la pressione di selezione sulla linea femminile (1) e sono utilizzate in campo animale non necessariamente per la cura della fertilità ma principalmente per aumentare il numero di embrioni prodotti da ogni singola donatrice. L'altro aspetto importante riguarda la possibilità di sfruttare a fini selettivi, attraverso queste tecniche riproduttive e genotipizzando gli embrioni, i dati che vengono messi a disposizione dalla mappatura del genoma. Produzione di embrioni in vivo (MOET) Nelle specie monouvulanti come i ruminanti ogni femmina può generare un numero molto ridotto di progenie. Per aumentare questo numero e sfruttare meglio dal punto di vista riproduttivo femmine di particolare valore genetico si ricorre a trattamenti farmacologici che portano ad ovulazione un numero superiore di follicoli. Gli embrioni ottenuti vengono rimossi con un lavaggio uterino e sono impiantati in bovine riceventi di scarso valore genetico che porteranno a termine la gravidanza. In questo settore possiamo già parlare di una vera e propria industria sia per i numeri di embrioni prodotti ogni anno nel mondo (circa mezzo milione) (2) sia perché dopo congelamento gli embrioni sono commercializzati in tutto il mondo. Un numero limitato di embrioni sono prodotti anche da suini, ovini, caprini, bufali e cavalli. Produzione di embrioni bovini in vitro Un numero elevato di ovociti è presente nelle ovaie al momento della nascita, ma solo una piccola parte viene fisiologicamente utilizzata a fini riproduttivi, mentre la maggior parte é persa attraverso il processo di atresia. Le tecniche di produzione in vitro degli embrioni si basano sul prelievo di ovociti che hanno completato la fase di crescita all'interno del follicolo ovarico. Solo gli ovociti presenti in follicoli con diametro oltre 2 mm contengono un ovocita che è competente per il successivo sviluppo embrionale (3). Gli ovociti vengono prelevati dalle ovaie dopo la macellazione dell'animale ( 4, 5, 6) oppure dagli animali vivi per via transvaginale ecoguidata (7). La tipologia dell'embrione prodotto varia in funzione delle modalità di raccolta degli ovociti e del valore genetico delle donatrici. Negli ultimi venti anni notevoli progressi sono stati fatti nella maturazione degli ovociti in vitro; molto importanti sono le interazioni, durante le prime ore di maturazione, tra le cellule che circondano l'ovocita (cellule della granulosa) e l'ovocita stesso (8). La maturazione in vitro viene ottenuta in circa 24 h di coltura in condizioni di temperatura ed atmosfera controllata; successivamente, seme congelato utilizzato normalmente per la fecondazione artificiale viene preparato per la fecondazione in vitro, gli spermatozoi vengono separati mediante centrifugazione, capacitati con l'aggiunta di eparina e messi in contatto con gli ovociti maturi (9). Dopo h di coltura in presenza di spermatozoi, gli ovociti vengono trasferiti in un medium idoneo allo sviluppo embrionale e in 7 giorni raggiungono lo stadio di blastocisti, stadio in cui possono venire impiantati per via transcervicale nell'utero di una bovina ricevente oppure congelati e conservati in azoto liquido fino al momento dell'impianto (6). L'efficienza della maturazione in vitro è molto elevata

2 (oltre il 90% degli ovociti raggiunge la seconda metafase) come pure quella della fecondazione in vitro (oltre il 70%). La fase più critica (anche per la sua durata temporale) è lo sviluppo dell'ovocita fecondato a blastocisti (oscilla tra il 30-40%). La coltura degli zigoti di bovino nell'ovidotto di pecora (10) permette di superare la maggior parte dei limiti imposti da sistemi di coltura inadeguati. Tuttavia, con il continuo sviluppo di nuove formulazioni di medium semi-definiti (SOF, 11; CR1, 12) si ottengono oggi embrioni di buona qualità ed idonei al congelamento. Ovum Pick Up (OPU) La tecnica OPU permette di produrre da ogni singola donatrice un elevato numero di embrioni con padri diversi in situazioni fisiologiche più disparate (dai due mesi di età fino al quarto mese di gravidanza). Dopo il prelievo gli ovociti vengono trattati come descritto sopra per la produzione in vitro. Oltre alla maggior probabilità di produrre embrioni rispetto alle tecniche tradizionali l'opu permette, utilizzando donatrici prepuberi, di ridurre notevolmente l'intervallo generazionale aumentando il progresso genetico (13). Inoltre consente di poter utilizzare per la fecondazione un toro diverso ad ogni prelievo di ovociti ottenendo in poco tempo molti embrioni da una determinata donatrice con tutti gli accoppiamenti desiderati. Queste tecniche di miglioramento genetico sulla linea femminile trovano la loro migliore applicazione all'interno dei nuclei di selezione, dove sono allevati e riprodotti intensivamente animali geneticamente superiori. L'OPU inoltre, rappresenta anche l'unica possibilità per produrre embrioni da donatrici fino al 3-4 mese di gravidanza, da donatrici ipofertili o sterili ed in alcuni casi svolge anche un effetto terapeutico con il recupero della carriera riproduttiva della donatrice. Durante il prelievo degli ovociti la donatrice è contenuta in un travaglio, è sedata e sottoposta ad anestesia epidurale. Il prelievo è abbastanza rapido, la sonda ecografica viene inserita in vagina e l'ovaio avvicinato alla sonda per via transrettale. Un secondo operatore muove l'ago che é montato sulla sonda aspirando così i follicoli visualizzati per via ecografica. In media si aspirano follicoli e si raccolgono 8-10 ovociti nell'arco di minuti. Il prelievo è effettuato in genere due volte per settimana e ripetuto in funzione del numero di embrioni richiesto per molte settimane senza provocare alcuna lesione alla donatrice. Alla sospensione dei prelievi la donatrice manifesta un calore fertile entro 7-10 giorni. Un altro vantaggio di questa tecnica è che non è richiesto nessun trattamento ormonale soprattutto se il prelievo viene effettuato con regolarità 1-2 volte la settimana; questo è particolarmente importante per gli animali giovani e per le vacche ipofertili. Nel caso si utilizzino vitelle donatrici di poche settimane, il prelievo degli ovociti viene effettuato per via laparotomica, visualizzando l'ovaio e aspirando direttamente i follicoli (13). Analisi genetiche preimpianto La possibilità di accedere alle fasi di sviluppo dell'embrione preimpianto sia con la tecnica del MOET, sia con la tecnologia in vitro, permette di effettuare indagini analitiche su una biopsia (alcune cellule) dell'embrione. In particolare la diagnosi del sesso dell'embrione sta diventando una pratica consolidata come anche la diagnosi di alcune malattie genetiche. La determinazione del sesso è basata sull'amplificazione di sequenze specifiche localizzate sul cromosoma Y, utilizzando sonde molecolari con la tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) (14). Altre due malattie genetiche (BLAD e CVD) possono essere diagnosticate su biopsia di embrione e / o contemporaneamente alla determinazione del sesso. Con le informazioni generate dallo studio e mappatura del genoma bovino sarà in futuro possibile identificare marcatori associati a QTL o ad altri caratteri (resistenza alle malattie, fertilità, ecc.) che potranno essere utilizzati per identificare caratteristiche genotipiche degli embrioni prima dell'impianto, aumentando così l'accuratezza della selezione e riducendo i costi. Per quest'ultimo tipo di analisi tuttavia è necessario sviluppare tecniche di amplificazione totale del genoma oppure moltiplicare in coltura le cellule prese con la biopsia per avere sufficiente DNA genomico che consenta la ricerca di più marcatori (15).

3 Sessaggio del seme La disponibilità di seme sessato permette la produzione di embrioni a sesso predeterminato. I quantitativi ancora piuttosto limitati di spermatozoi sessati che si possono ottenere con le apparecchiature attuali, rendono l'utilizzo del seme sessato particolarmente indicato per la fecondazione in vitro (16). Oltre al numero limitato di spermatozoi ottenibili con la tecnologia attuale, il seme che è passato attraverso il citofluorimetro per la separazione ha una motilità molto ridotta. Quest'ultima caratteristica rende particolarmente indicato l'utilizzo di tecniche di microfecondazione (ICSI, iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi) che però nel bovino sono ancora in fase di messa a punto (17), al contrario di quanto avviene per la specie umana dove l'icsi è largamente utilizzata con successo. Clonazione La clonazione animale consiste nel creare copie genomiche di embrioni, feti o individui adulti. Si utilizzano ovociti maturi che vengono svuotati del loro nucleo nei quali viene successivamente introdotto il nucleo di una cellula di un embrione o di un feto o di un adulto. L'embrione così ricostruito viene attivato e lo sviluppo embrionale riparte come se fosse un embrione normale. In passato l'utilizzo di questa tecnica era limitato all'utilizzo di cellule dell'embrione e il numero limitato di cellule disponibili e la bassa efficienza della tecnica di clonazione non ne ha permesso lo sviluppo commerciale (18). Le recenti acquisizioni nel campo della clonazione somatica (19) hanno creato le premesse per un radicale cambio del sistema di allevamento del bovino. Si prospetta quindi la possibilità, già utilizzata in campo vegetale, di avere dei nuclei di selezione dove gli animali saranno selezionati e riprodotti seguendo le tecniche descritte sopra; quindi, gli animali con le caratteristiche richieste saranno clonati e gli embrioni saranno venduti agli allevamenti commerciali. La clonazione somatica da animali adulti permette di utilizzare a fini produttivi animali di provato valore che sarà mantenuto inalterato o quasi durante la riproduzione per clonazione (20, 21). Questi embrioni (animali) saranno ovviamente del sesso desiderato e adattabili alle diverse situazioni ambientali dei diversi allevamenti commerciali, potranno essere successivamente riprodotti con tecniche tradizionali o fungere da riceventi per altri embrioni clonati. La nascita di Galileo, clone di Zoldo, toro di razza bruna ottenuto dal nostro laboratorio nel gennaio del 1999, rappresenta un chiaro esempio delle potenzialità della clonazione sia per chiarire aspetti di biologia dello sviluppo (Galileo è stato ottenuto da un leucocita di Zoldo) che per possibili impieghi zootecnici (Zoldo era allora il primo toro italiano nella razza bruna e tra i primi al mondo). Alla clonazione di Galilea hanno fatto seguito tre cloni di Mtoto (22), un importante riproduttore di razza Frisona, due cloni di Bassora, una vacca bruna di particolare valore e un clone di Zapping, una campionessa di razza frisona. Di recente il nostro laboratorio ha clonato Prometea, il primo clone di cavallo al mondo (23). La clonazione somatica necessita di ulteriori ricerche affinché possa essere utilizzata su larga scala a fini commerciali. Il limite attuale sta nel fatto che una elevata percentuale di gravidanze ottenute con tali embrioni viene riassorbita, infatti solo il 5-10% delle gravidanze ottenute va a termine. Va evidenziato il fatto che gli animali clonati come spra descritto sono copie genetiche, cioè dei gemelli monozigoti dell animale originale. Nonostante questo aspetto di fatto esiste una moratoria sull utilizzo agroalimentare degli animali clonati basata su pregiudizi, in quanto l evidenza scientifica preliminare non fornisce alcun elemente per ritenere questi animali e i loro prodotti un rischio per la salute. Le informazioni generate dalla mappatura del genoma combinate con le tecniche di clonazione somatica rendono le modificazioni genetiche possibili anche nel bovino. Le caratteristiche che potrebbero essere modificate vanno dai caratteri produttivi, alla resistenza alle malattie, alla produzione di farmaci complessi, agli organi per i trapianti. Mentre l'utilizzo della transgenesi per la produzione di farmaci (24) viene generalmente accettata, l ipotesi di una transgenesi per produrre derrate alimentari di origine animale è ancora oggetto di

4 discussione sia per quanto riguarda la salubrità di tali prodotti da un punto di vista alimentare sia per la diffidenza spesso infondata di parte dell'opinione pubblica. Bibliografia 1 Lohuis, M.M. (1995). Potential benefits of bovine embryo-manipulation technologies to genetic improvement programs. Theriogenology, 43: Thibier, M. The 1998 statistical figures for the worldwide embryo transfer industry: a data retrieval committee report. Embryo Transfer Newsletter, December 1999, volume 17, 4: Galli, C and Moor, R.M. (1991). Development of immature bovine oocytes into viable embryos in vitro. Bulletin de l'association des Anatomistes, 75, 228: Galli, C. and Lazzari, G. (1994). Large scale production of bovine embryos. Proceedings of the First European Conference on Progress in Embryo Technology and Genetic Engineering in Cattle and Sheep Breeding. Krakòw, Poland, pp Lazzari, G. and Galli, C. (1993). Salvage of valuable germplasm of sterile cattle by in vitro technologies. 9e Réunion Association Europeenne de Transfert Embryonnaire pp Lyon September. 6 Galli, C. and Lazzari, G. (1996) Practical aspects of IVM/IVF in cattle. Animal Reprod. Sci. 42: Galli C, Crotti G, Notari C, Turini P, Duchi R and Lazzari G. (2001). Embryo production by ovum pick up from live donors. Theriogenology, 55: Staigmiller, R.B. and Moor, R.M. (1984). Competence of ovine oocytes matured outside the follicle. Gamete Res. 9: Parrish, J.J., Susko-Parrish, J.L. and Leibfried-Rutledge, M.L. (1986). Bovine in vitro fertilisation with frozen-thawed semen. Theriogenology 25: Eyestone, W.H., Leibfried-Rutledge, L., Northey, D.L., Gillman, B.G. and First, N.L., Culture of bovine one and two-cell bovine embryos to the blastocyst stage in the ovine oviduct. Theriogenology, 28: Tervit, H.R., Whittingham, D.G. and Rowson, L.E.A. (1972). Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J. Reprod. Fert., 30: Rosenkrans, C.F. and First, N.L. (1994). Effect of free amino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovine zygotes in vitro. J. Anim. Sci., 72: Lazzari, G., Duchi, R., Landriscina, R., Colombo, N. and Galli, C. (1996) Developmental capacity of IVM/IVF calf oocytes from ecg stimulated donors of 2-3 months of age. J. Reprod. Fert. Abstract Series No17: Thibier, M. and Nibart, M. (1995). The sexing of bovine embryo in the field. Theriogenology 43: Georges, M. (1999). Towards marker assisted selection in livestock. 15e Réunion Association Europeenne de Transfert Embryonnaire pp Lyon September. 16 Cran, D.G., Johnson, L.A., Miller, N.G.A., Cochrane, D. and Polge, C. (1993). Production of bovine calves following separation of X- and Y- chromosome bearing sperm and in vitro fertilisation. Vet. Rec., 132: Galli, C. Crotti, G., Notari, C. and Lazzari G. (1999). High rate of activation and fertilisation following intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) in cattle. Theriogenology 51: Bondioli, K.R. (1993). Nuclear transfer in cattle. Mol. Reprod. Dev., 36, Wilmut, I, Schnieke, A.E., Mcwhir, J., Kind, A.D. and Campbell, K.H.S. (1997). Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385: Galli, C., Duchi, R., Moor, R.M. and Lazzari, G. (1999). Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning 1: Wells, D.N., Misica, P.M. and Tervit, R.H. (1999). Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosa cells. Biol. Reprod. 60:

5 22 Galli C, Duchi R, Crotti G, Ponderato N, Colleoni S, Lagutina I, Lazzari G. (2003). Bovine embryo technologies. Theriogenology, 59, Galli C, Lagutina I, Crotti C, Colleoni S, Turini P, Ponderato N, Duchi R, Lazzari G. Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin. Nature Aug 7;424(6949): Schnieke, A.E., Kind, A.J., Ritchie, W.A., Mycock, K., Scott, A.R., Richie, M., Wilmut, I., Colman, A. and Campbell; K.H.S. (1997). Human factor IX transgenic sheep produced by tranfer of nuclei from tranfected fetal fibroblasts. Science, 278: