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1 CORSO ECM FAD FERTILITÀ A 360 : SPUNTI E NUOVE RIFLESSIONI NELLA PMA Modulo Didattico 1: Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile: il processo di mediazione tra aspettative e bisogni, evidenze disponibili e vincoli normativi. A cura di: Dott.ssa Laura Benaglia, Medico in Ginecologia e Ostetricia, Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena, U.O. Sterilità di Coppia, Milano. Obiettivi formativi Al termine di questo modulo didattico il Medico dovrebbe essere in grado di: conoscere l epidemiologia e l eziologia della sterilità; valutare una coppia infertile; effettuare un corretto counseling alla coppia infertile; comprendere la normativa, con particolare riferimento alla legge 40/2004. Definizioni, epidemiologia ed eziologia Definizioni La definizione di sterilità è ancora dibattuta. Al momento, la più utilizzata è assenza di concepimento dopo almeno un anno di rapporti sessuali liberi regolari. Viene poi distinta in primaria, se non si sono mai avute gravidanze in passato, e secondaria, se invece questa condizione emerge dopo uno o più precedenti gravidanze. Si definisce come indice di fecondità di una coppia la probabilità di concepire al mese (MFR: Monthly Fecundity Rate). Questa probabilità è ritenuta praticamente costante ma è ben lontana da uno. In coppie giovani e sane, si ritiene che sia in media di circa 20% ma c è indubbiamente un ampia variabilità. Ne consegue che il 7% delle coppie normali, con un indice di fecondità del 20%, non ha ancora concepito dopo un anno di ricerca, che quasi il 50% delle coppie a fertilità gravemente ridotta riesce a concepire entro i 5 anni e, infine, che solo le coppie con un indice di fertilità uguale a zero non concepiranno mai 1. Parole chiave: sterilità, indice di fecondità Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 1

2 Epidemiologia La frequenza della sterilità è stimata essere circa il 10-15%. Nel mondo, secondo i dati dell OMS del 1995, esistono milioni di coppie sterili. Si stimano circa 3 milioni di coppie sterili in Europa Occidentale, con nuovi casi diagnosticati all anno. In Italia ogni anno ci sono circa matrimoni e coppie di fatto, di cui il 40% richiede una consulenza specialistica presso un Centro Sterilità 2. Eziologia Esistono quattro principali categorie di cause di sterilità, maschile, ovulatoria, anatomica e inspiegata, e la loro frequenza relativa è molto simile (circa 25%) (vedi Tabella 1) 2. Tabella 1. Frequenza relativa delle cause d infertilità in funzione del livello di cura Cause I livello II livello III livello Fattore maschile 20% 26% 24% Fattore anatomico a 11% 20% 30% Fattore ovulatorio 24% 21% 18% Inspiegata b 45% 33% 28% a Incluse endometriosi III-IV stadio b Incluse endometriosi I-II stadio Per quanto riguarda la prima categoria, il fattore maschile è responsabile del 20-26% dei casi di subfertilità. La diagnosi si basa essenzialmente sull esame seminale. I valori di normalità dell esame e i principali termini di semantica sono riportati in Tabella 2. Il termine di dispermia si riferisce ad anomalie dell esame in genere, il termine normospermia rivela un quadro di totale normalità. Si definisce la gravità dell infertilità maschile prevalentemente sulla base delle caratteristiche del liquido seminale basale. L'esame seminale viene eseguito prelevando per masturbazione un campione di seme dopo un periodo di astinenza di 2-5 giorni. L'esame non andrebbe eseguito dopo un evento febbrile, perché può risultare erroneamente alterato. Si definisce azoospermia l assenza di visualizzazione di spermatozoi nel liquido seminale esaminato. Inoltre, la patologia seminale può essere clinicamente suddivisa in oligozoospermia moderata, se vi è la presenza di un numero di spermatozoi compreso tra 10 e 20 milioni/ml, oligozoospermia grave se è presente un numero di spermatozoi inferiore a 10 milioni/ml e, infine, criptozoospermia se il numero di spermatozoi visualizzato è < 1 milione/ml. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 2

3 Tabella 2. Esame seminale e definizioni 14 Variabili Valori di normalità Definizioni Quantità 2-6 ml Ipoposia se < 2 ml Iperposia se > 6 ml Aspermia se assenza di liquido seminale ph Concentrazione 20 milioni/ml Oligozoospermia se < 20 milioni/ml Criptozoospermia < 1 milione/ml Azoospermia se assenza totale di spermatozoi Motilità progressiva 50% Astenozoospermia se < 50% Morfologia 14% Teratozoospermia se < 14% Cellule Rotonde 1 Milione/ml Leucospermia se > 1 milione/ml Nel 2010 sono stati riscritti i parametri del liquido seminale dalla OMS con i seguenti parametri: Volume 1.5 ml, ph 7.2, Concentrazione 15 milioni / ml, N totale spermatozoi 39 milioni, Motilità Totale 40%, Motilità Progressiva rapida 32%, Vitalità 58%, Morfologia 4%. Per quanto riguarda il fattore anatomico, la patologia tubarica è un fattore causale di sterilità femminile nel 25-35% dei casi. La patologia infiammatoria pelvica è la causa più frequente ed è responsabile di oltre il 50% dei casi di patologia tubarica. Anche la pregressa sterilizzazione tubarica per contraccezione costituisce una percentuale consistente di sterilità di origine tubarica (21-26%). È riportata in letteratura una probabilità di gravidanza spontanea non superiore al 3% in pazienti con ostruzione tubarica. Le alternative di trattamento per l infertilità tubarica sono la chirurgia ricostruttiva e la FIVET che, grazie alla sua capacità intrinseca di ovviare al problema anatomico, dagli anni 80 ha quasi totalmente sostituito la chirurgia, ottenendo percentuali di successo molto alte 4. Altro fattore anatomico importante è l endometriosi. L endometriosi, definita come la presenza di tessuto endometriale al di fuori della cavità uterina, è una patologia enigmatica, la cui patogenesi rimane ancora discussa. La prevalenza dell endometriosi è circa del 10% nella popolazione generale e si stima che possa raggiungere il 25-40% nella popolazione infertile. Essa può determinare quadri anatomici molto variabili, da piccole lesioni superficiali peritoneali a quadri di sovvertimento anatomico importanti (diffuse aderenze pelviche, cisti ovariche, impianti peritoneali profondi) fino a danneggiare organi circostanti quali in particolare l intestino, gli ureteri Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 3

4 o la vescica. L endometriosi determina tipicamente algie pelviche e infertilità. L impatto sulla fertilità è per lo più mediato dall alterazione dei rapporti anatomici, dovuti alle aderenze e alla situazione infiammatoria locale che interferisce sui processi di fecondazione quali trasporto degli spermatozoi, qualità ovocitaria, fecondazione e trasporto embrionale. Infine i fibromi uterini sottomucosi e polipi endometriali sono cause note di infertilità perché alterano l impianto embrionale 5,6. Il fattore ovulatorio comprende invece quadri diagnostici diversi: l ipogonadismo ipogonadotropo è dovuto a un ipofunzionalità ipotalamica-ipofisaria e generalmente si associa ad anomalie mestruali. Si tratta spesso di pazienti con massa grassa troppo ridotta, quali pazienti con un BMI troppo basso ( 17 kg/m 2 ) e quelle che svolgono un attività fisica intensa (sportive, danzatrici). In queste pazienti, la presenza d irregolarità mestruali associate all esito del prelievo ormonale consente di diagnosticare questa condizione. Il secondo quadro clinico è quello della Sindrome dell ovaio policistico (Polycistic Ovarian Syndrome, PCO) in cui la diagnosi si basa sulla presenza di almeno due di tre criteri (anomalie del ciclo mestruale, segni clinici o biochimici d iperandrogenismo e AFC, conta dei follicoli antrali, 10 per ovaio). Infine esiste l ipogonadismo ipergonadotropo o da ridotta riserva ovarica, che si associa a una riduzione della qualità ovocita ria; è quindi cruciale identificare questa situazione nell ambito di un processo diagnostico dell infertilità. L insorgenza di un irregolarità ciclica è un sintomo molto tardivo di questa situazione. Ancorché più precoce, l innalzamento dei livelli di FSH è anch esso tardivo. Al riguardo occorre sottolineare che i livelli di FSH nella fase di transizione verso una compromissione definitiva della riserva ovarica hanno oscillazioni molto importanti. La sterilità viene definita a eziologia sconosciuta quando il fallimento del concepimento persiste per almeno un anno nonostante rapporti frequenti e indagini diagnostiche nella norma. La percentuale media mensile di gravidanza per coppia riportata in letteratura è circa del 20% 2. Nonostante le avanzate tecniche diagnostiche, si stima che l incapacità di concepire spontaneamente per una coppia rimane inspiegato nel 25-30% dei casi. Parole chiave: sterilità causa maschile, causa ovulatoria, causa anatomica e causa inspiegata Valutazione della coppia La valutazione della paziente infertile è sempre una valutazione di coppia. In questo ambito, occorre sottolineare la particolare importanza di tre elementi: età femminile, durata della ricerca e precedenti gravidanze della coppia e dei singoli partner individualmente. Per sintetizzare il processo diagnostico, nella Tabella 3 sono specificate nel dettaglio le voci da considerare nell anamnesi sia della donna sia del partner maschile e nella Tabella 4 sono riportati Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 4

5 gli esami ematochimici e strumentali di I e II livello. Gli esami di I livello devono essere sistematicamente prescritti. In funzione dell esito di questi, si procederà a prescrivere in modo selettivo quelli di II livello. Tabella 3. Anamnesi della coppia infertile Tipo di anamnesi Donna Uomo Familiare Età della menopausa in famiglia Fibrosi cistica Generale Durata della ricerca Durata della ricerca Ostetrico-ginecologica Età Precedenti interventi addomino-pelvici (peritonite) Tumori (radio o chemioterapia) Fumo Precedenti gravidanze (parti naturali e cesarei, aborti, gravidanze extrauterine) Caratteristiche dei cicli mestruali (frequenza, regolarità, dismenorrea) Altri sintomi ginecologici (dispareunia, algie intermestruali) Precedenti episodi di Malattia Infiammatoria Pelvica (PID) Storia sessuale Precedenti interventi ginecologici (endometriosi, miomi, sterilizzazione ) Pregresso utilizzo di IUD (per rischio aumentato di PID) Età Precedenti interventi pelvici (ernioplastica inguinale, interventi sul collo vescicale) Tumori (radio o chemioterapia) Fumo Precedenti gravidanze Discesa testicolare (criptorchidismo) Epididimite-orchite (parotite in età adulta) Traumi testicolari Storia sessuale Precedenti interventi andrologici (varicocele, criptorchidismo, sterilizzazione ) Tabella 4. Esami di primo e secondo livello nella coppia infertile Partner Esami I livello Esami II livello Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 5

6 Donna Ecografia transvaginale Isterosalpingografia Esami ormonali (FSH, LH, E2, AMH, TSH, PRL, progesterone) Anticorpi anti Chlamydia Isterosonografia Isteroscopia Laparoscopia Esami genetici (cariotipo, sindrome dell X fragile FRAXA) Testosterone, androstenedione Uomo Esame seminale (2 valutazioni) Ormonali (FSH, LH, testosterone) Ecografia scrotale + Doppler Ecografia transrettale Test di Stamey Esami genetici (cariotipo, microdelezioni del cromosoma Y, mutazione del gene della fibrosi cistica) Biopsia testicolare Opzioni terapeutiche Le prospettive terapeutiche per le coppie sterili sono tre: le induzioni dell ovulazione con rapporti mirati e le due esistenti tecniche di procreazione medicalmente assistita. Con procreazione medicalmente assistita (PMA) s intendono tutte quelle tecniche volte ad aumentare la fertilità di una coppia, tecniche che prevedono la manipolazione di uno o di entrambi i gameti. Induzione dell ovulazione con rapporti mirati In presenza di un liquido seminale fisiologico esiste la possibilità di indurre farmacologicamente l ovulazione e, monitorando il giorno dell ovulazione, si può individuare la fase del ciclo a più alta probabilità di concepimento al fine di orientare proprio in questo periodo i rapporti sessuali. Numerosi studi nel decennio passato hanno paragonato queste due procedure in termini di gravidanze ottenute. Una revisione della letteratura su 3662 cicli ha confrontato l inseminazione intrauterina (IUI) rispetto ai rapporti sessuali mirati, con o senza stimolazione ovarica. In entrambe le analisi, la probabilità di gravidanza è risultata significativamente maggiore nelle pazienti sottoposte a IUI rispetto ai rapporti mirati associati o meno all induzione dell ovulazione 7. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 6

7 La ragione di questa divergenza non è chiara. È stato ipotizzato che, dopo il picco di LH, avvenga un deterioramento qualitativo del muco cervicale che rende ostile il passaggio spontaneo degli spermatozoi; ciò giustificherebbe la maggiore efficacia della IUI che prevede l inserimento direttamente in utero del seme. L induzione dell ovulazione associata ai rapporti mirati può tuttavia essere considerata un valido primo approccio terapeutico in coppie giovani con una ricerca di prole non prolungata e un esame del liquido seminale pressoché nella norma. Tecniche di PMA in vivo La fertilizzazione, ossia l incontro dei gameti con formazione dello zigote, avviene all interno dell organismo materno. Per effettuare una PMA in vivo devono esistere delle condizioni permittenti: - vie genitali femminili pervie e funzionanti; - cavità uterina normale; - presenza di almeno un ovaio funzionante; - presenza di un numero sufficiente di spermatozoi nel liquido seminale (i cut-off possono essere diversi secondo le tecniche d inseminazione, ma in genere si considera un cut-off di di spermatozoi mobili per cc dopo preparazione del seme). Sono ormai quasi totalmente cadute in disuso le inseminazioni intracervicali, che non richiedono la preparazione del seme e possono essere praticate con facilità. Un volume di 0,3-0,5 ml di seme intero, preferibilmente costituito dalla prima parte dell eiaculato, viene posizionato nella cervice o addirittura in vagina in prossimità dell ovulazione. A cause delle maggiori probabilità di successo, le inseminazioni intrauterine (IUI) sono la tecnica di PMA maggiormente utilizzata dai Centri di Medicina della Riproduzione. Le IUI consistono nella preparazione del seme maschile e dell introduzione di esso nell utero della partner dopo una stimolazione ormonale con induzione dell ovulazione. Tecniche di PMA in vitro La FIVET (Fertilization In Vitro Embryo Transfer) è una procedura che consente di ottenere una fecondazione extracorporea dell ovocita e di posizionare poi gli embrioni così ottenuti all interno della cavità uterina, dove è possibile ottenerne l impianto e quindi iniziare una gravidanza. Pertanto in seguito alla stimolazione ovarica, che viene utilizzata anche per altre tecniche di PMA in dosi e Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 7

8 modalità differenti, si procede al prelievo degli ovociti, alla loro inseminazione e al trasferimento degli embrioni ottenuti. La ICSI (Intracytoplasmatic Sperm Injection) consiste nell iniezione intracitoplasmatica degli spermatozoi; questa tecnica garantisce la fecondazione di ovociti anche alla presenza di oligoastenoteratospermia grave. Prelievo degli ovociti (pick-up ovocitario) Si tratta di una procedura che permette di portare all esterno gli ovociti mediante puntura dei follicoli ovarici. La paziente è sottoposta a profilassi antibiotica la sera prima del pick-up (ceftriaxone 1 g i.m.), a premedicazione 30 minuti prima della procedura con prometazina 25 mg i.m. e atropina 0,25 mg i.m. e ad analgesia immediatamente prima del pick-up stesso (midazolam 5 mg in 10 ml di fisiologica e.v. ed eventualmente fentanil 0,1 mg e.v.). Il prelievo è eseguito ambulatorialmente utilizzando un lungo ago sterile e un apparecchio ecografico con sonda vaginale a 5 o 6,5 Mhz dotata di una guida per l ago stesso. Il liquido follicolare contenente gli ovociti è aspirato mediante una pompa a suzione ed è raccolto in provette sterili che sono immediatamente consegnate al biologo che provvede a riconoscere e posizionare gli ovociti in piastre di Petri, unitamente al medium di coltura. Inseminazione e fecondazione in vitro Gli ovociti posizionati in medium di coltura sono poi esaminati per la valutazione del grado di maturità e successivamente, circa 4 ore dopo il pick-up, sono inseminati con una microgoccia di spermatozoi preventivamente preparati a partire dal liquido seminale del partner. Dopo circa 18 ore dall inseminazione è possibile valutare la presenza di pronuclei che segnalano l avvenuta fertilizzazione. Dopo altre 12 ore la cellula uovo fertilizzata comincia a dividersi: si ottiene così un pre-embrione. Dopo 48 ore dal pick-up il pre-embrione è di norma a 2-4 cellule e può essere trasferito. L attesa di altre 24 ore permette di ottenere embrioni a 6-8 cellule che consentono una migliore valutazione della loro qualità e una migliore selezione degli embrioni da trasferire. L introduzione nel 1992 dell iniezione intracitoplasmatica degli spermatozoi (ICSI), ha portato a una rivoluzione nel trattamento della grave infertilità maschile. La ICSI consiste nella microiniezione di un singolo spermatozoo nel singolo ovocita, precedentemente selezionato in metafase II. Pertanto con questa tecnica è possibile ottenere fertilizzazione ovocitaria e gravidanza indipendentemente dai parametri seminali e quindi anche in presenza di grave oligozoospermia o criptozoospermia. Recentemente è stata introdotta una nuova metodologia detta IMSI (iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi morfologicamente selezionati, Intracytoplasmic Morphologically-selected Sperm Injection) che permette di selezionare gli spermatozoi che Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 8

9 presentano la morfologia migliore, senza usare coloranti, ma mediante l utilizzo di un microscopio ad altissimo ingrandimento (6000x). Tale metodica si basa sull evidenza di una correlazione tra grado di frammentazione del DNA del liquido seminale e alcune caratteristiche della morfologia degli spermatozoi. Il problema è che a volte spermatozoi che presentano una buona morfologia e una buona motilità, quindi definibili nella norma, presentano alterazioni del DNA. Si evince, quindi, che non è sufficiente la sola valutazione della morfologia degli spermatozoi per sperare in una gravidanza con esiti positivi. In un lavoro del 2008 sono state valutate le percentuali di gravidanza e di aborto in precedenti cicli di fecondazione in vitro falliti, confrontando ICSI e IMSI eseguite in soggetti con grave alterazione dei parametri del liquido seminale (oligoastenoteratospermia) o con sterilità inspiegata. Con la IMSI, rispetto alla ICSI, si sono ottenute percentuali di gravidanza significativamente più alte (39,2% vs 26,5%) e minori percentuali di aborto 8. Benché siano diversi i lavori pubblicati nei quali questa nuova metodologia ha avuto esiti positivi e che ne mettono in evidenza gli indubbi vantaggi in alcuni casi di sterilità, è ancora troppo presto per poter affermare con certezza gli esiti positivi della IMSI in quanto le casistiche sono insufficienti per trarre conclusioni definitive sulle sue effettive utilità ed efficacia. Trasferimento dell embrione (embryo transfer) Il trasferimento degli embrioni è ora più frequentemente eseguito trascorse 72 ore dal pick-up: come si è detto, attendere altre 24 ore oltre le canoniche 48 si è dimostrato utile nel migliorare i tassi d impianto poiché è possibile in questo modo selezionare e trasferire embrioni allo stadio di 6-8 cellule, embrioni che sono quindi qualitativamente migliori e che potrebbero avere migliori possibilità d impianto. Il numero degli embrioni che sono trasferiti è variabile: attualmente, visto che è possibile la criopreservazione degli embrioni stessi, ne vengono trasferiti due fino a un massimo di tre. La procedura dell embryo transfer è ambulatoriale, non richiede analgesia ed è molto semplice: gli embrioni sono sospesi in una goccia di medium di coltura e sono aspirati in un sottile catetere, dotato di un mandrino che consente di superare agevolmente l orifizio uterino interno. Parole chiave: IUI, FIVET, ICSI, IMSI Percorso per la paziente sottoposta a tecniche di PMA Tutte le tecniche di PMA comportano tre momenti comuni: l induzione della superovulazione, il monitoraggio ecografico/ormonale e la preparazione dei gameti maschili. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 9

10 L induzione della superovulazione Nonostante la prima gravidanza a termine della storia della fecondazione in vitro (FIV) sia stata ottenuta in un ciclo naturale, nella grandissima maggioranza dei casi sono stati e vengono utilizzati protocolli di stimolazione ovarica controllata. Tali protocolli, sia pure con differenze importanti, sono basati su tre punti fondamentali: stimolazione della crescita follicolare multipla; prevenzione del picco prematuro di LH; induzione finale dell ovulazione. Stimolazione della crescita follicolare multipla Fino a circa un decennio fa la principale riserva di FSH esogeno utilizzata a scopi terapeutici nei casi d infertilità era quella estratta dalle urine di donne in menopausa. Negli ultimi anni, i progressi dell'ingegneria biochimica hanno consentito di ottenere la sintesi in laboratorio di gonadotropine ricombinanti, caratterizzate da elevata purezza e da illimitata disponibilità. Una prima review sugli studi randomizzati in cui è stato confrontato l utilizzo dell FSH ricombinante (rfsh) rispetto all FSH urinario (ufsh) nei protocolli di stimolazione ovarica controllata, ha evidenziato un vantaggio per il prodotto ricombinante relativamente alla clinical pregnancy rate (OR 1,21; 95% IC 1,04 1,42) e alla ongoing pregnancy (OR 1,29; 95% IC 1,08 1,54). Nessuna differenza significativa è stata rilevata per il tasso di aborti spontanei, di gravidanze multiple e d iperstimolazione ovarica 9. L utilizzo del rfsh ha richiesto una quantità totale di gonadotropine espresse come U.I. più bassa rispetto all ufsh, ma non vi sono state differenze nel numero di follicoli, nei livelli medi di estradiolo e nel numero di ovociti recuperati. In una seconda metanalisi sono stati comparati l rfsh e le varie formulazioni di gonadotropine urinarie (hmg, FSH purificato, FSH-P, e FSH altamente purificato, FSH-HP) 10. Non sono state identificate differenze significative nella pregnancy rate per ciclo iniziato fra rfsh e gonadotropine urinarie (OR 1,07; 95% CI 0,94 1,22). La scelta del farmaco da utilizzare dovrebbe tener conto, quindi, di altri fattori, quali l accettabilità, la sicurezza, la disponibilità e il costo complessivo della terapia. Prevenzione del picco prematuro di LH La prevenzione del picco prematuro di LH si ottiene attraverso il blocco ipofisario. Il controllo della secrezione ipofisiaria è dato dal rilascio ipotalamico di ormone liberante le gonadotropine, GnRH, un decapeptide a catena singola, che è prodotto e liberato a livello del nucleo arcuato e dell area Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 10

11 preottica dell ipotalamo e che si lega a recettori specifici nell ipofisi anteriore. È dotato di emivita breve ed è rapidamente inattivato. Tramite modificazioni aminoacidiche nei punti di rottura del peptide sono stati creati analoghi del GnRH (GnRHa) con emivita maggiore e più alta affinità recettoriale. La somministrazione prolungata di GnRHa consente di ottenere la soppressione ipofisaria. I GnRHa disponibili sono molteplici in base alle modalità di somministrazione che possono essere per via nasale o sottocutanea/intramuscolare, con somministrazione quotidiana o mensile (preparati depot). Si possono distinguere due protocolli: il protocollo lungo e il protocollo breve, con la variante ultrabreve. Nel protocollo lungo la somministrazione del GnRHa è iniziata nella fase medio-luteale del ciclo precedente, e si ottiene la desensibilizzazione ipofisaria dopo circa giorni, dopo di che s inizia la somministrazione di gonadotropine. Nel protocollo breve e ultra-breve, la somministrazione è iniziata il primo giorno del ciclo per sfruttare l effetto flare-up, vale a dire la liberazione massiva di gonadotropine endogene che si verifica con la somministrazione di GnRHa, prima che s instauri il blocco ipofisario. In quest ultimo protocollo la somministrazione di gonadotropine è iniziata alcuni giorni dopo il GnRHa. Negli ultimi anni è stata sviluppata una nuova classe di farmaci in grado di determinare il blocco ipofisario in un tempo molto più breve: gli antagonisti del GnRH. Gli antagonisti inducono una rapida riduzione dei livelli di LH e FSH agendo con un meccanismo di inibizione competitiva del recettore ipofisario per il GnRH, bloccando completamente l ipofisi in poche ore. Essi sono pertanto in grado di prevenire e interrompere il picco di LH senza richiedere un intervallo di desensibilizzazione, per cui possono essere usati in fase follicolare. L introduzione nella pratica clinica dei GnRH-antagonisti ha portato a una riduzione del periodo di trattamento, del numero di fiale di gonadotropine utilizzate e dell incidenza della sindrome d iperstimolazione ovarica. Queste caratteristiche sono state convalidate da una review di studi clinici randomizzati 11. Non vi sono state differenze statisticamente significative riguardo la prevenzione del picco dell LH. Tuttavia, il numero di ovociti recuperati e di embrioni trasferiti è stato consistentemente minore nei soggetti trattati con l antagonista, a fronte di una minore quantità di gonadotropine utilizzate e di una minore durata della stimolazione 11. Un possibile utilizzo degli antagonisti del GnRH è stato proposto nell induzione della superovulazione in pazienti definite poor responder. In un recente studio sull utilizzo degli antagonisti del GnRH nelle pazienti poor responder, dal confronto tra protocollo con GnRHa in regime flare-up e protocollo con antagonista emerge invece una significativa riduzione dei cicli Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 11

12 cancellati e una maggior percentuale di gravidanze in corso in pazienti trattate con GnRH antagonisti 12. Induzione finale dell ovulazione L induzione finale dell ovulazione è stata ottenuta per molti anni esclusivamente con la somministrazione di gonadotropina corionica umana, hcg, di derivazione urinaria (uhcg). L hcg è in grado di simulare il picco dell LH endogeno, in virtù della sua analogia strutturale con quest ormone. Entrambi inducono, infatti, la luteinizzazione e stimolano l attività delle cellule luteiniche. Questi due ormoni differiscono, però, per le subunità beta e per la loro clearance. Il tasso di clearance plasmatica dell hcg è più basso di quello dell LH. La tecnologia ricombinante ha permesso di sviluppare e introdurre nella pratica clinica l hcg ricombinante (rhcg) e l LH ricombinante (rlh), con la possibilità di eliminare del tutto gli inquinanti urinari. L hcg ricombinante ha dimostrato una maggiore tollerabilità, con una riduzione dell incidenza di reazioni locali e di altri effetti indesiderati minori (OR 0,47; 95% CI 0,32 0,70) 13. Non essendo state rilevate differenze in termini di outcome clinico tra l utilizzo di hcg urinaria e ricombinante nell induzione finale dell ovulazione, la scelta del prodotto da utilizzare dovrebbe prendere in considerazione altri fattori quali la sicurezza, la tollerabilità e la disponibilità del farmaco. I protocolli di superovulazione maggiormente utilizzati sono illustrati in Figura 1. Figura 1. Protocolli di induzione della superovulazione Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 12

13 hcg hcg hcg Il monitoraggio della superovulazione Il monitoraggio della superovulazione è eseguito mediante ecografie transvaginali quotidiane. Mediante l ecografia è possibile, infatti, contare e misurare i diametri dei follicoli in crescita ed eventualmente aggiustare il dosaggio della terapia di superovulazione. Solitamente si pratica un ecografia basale prima di iniziare la terapia con gonadotropine o immediatamente prima la downregulation con GnRH-agonisti. Tale controllo ecografico serve a escludere la presenza di cisti ovariche. La seconda ecografia può, poi, essere eseguita dopo 5-7 giorni di stimolazione con le gonadotropine o, se si monitorizza anche l estradiolo plasmatico, dopo che la concentrazione di quest ultimo ha cominciato a salire. Il monitoraggio ecografico diventa poi solitamente quotidiano fino al giorno della somministrazione dell hcg. È anche possibile eseguire un monitoraggio del livello sierico dell estradiolo, attuabile però solo se il laboratorio è in grado di fornire in tempo reale i risultati. In caso non si utilizzi l iniezione di hcg per il trigger finale dell ovulazione, occorre anche il monitoraggio dell LH, per verificarne il picco preovulatorio e programmare l orario dell inseminazione. Questo monitoraggio è solitamente eseguito mediante stick urinari. La preparazione del seme La preparazione del seme è elemento fondamentale per i cicli di PMA: è indispensabile sia nella procreazione assistita in vivo sia in quella in vitro; dal liquido seminale devono essere selezionati gli spermatozoi con alto indice di motilità e con morfologia normale. Gli spermatozoi devono essere Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 13

14 inoltre separati dal plasma seminale e da altre forme cellulari talvolta presenti nel plasma (leucociti, detriti cellulari, spermatozoi morti ed eritrociti). Le tecniche che solitamente si utilizzano sono di due tipi: Swim-up e gradiente discontinuo di Percoll. Tecnica di Swim-up Questa tecnica sfrutta il movimento proprio degli spermatozoi e prevede la stratificazione di un dato volume di terreno di coltura (0,5-1 ml) sopra un equivalente volume di liquido seminale. Si lascia incubare per minuti a 37 C, poi si recupera lo strato di terreno nel quale si ritrovano gli spermatozoi con grado di mobilità migliore, che avranno nuotato fino alla superficie, e si procede a un lavaggio in terreni di coltura per concentrare gli spermatozoi selezionati nel volume desiderato. Tecnica a gradiente discontinuo di Percoll Il Percoll è una soluzione di polivinilpirrolidone con densità di 1,130 g/ml. È utilizzato per approntare una soluzione isotonica con la quale si preparano i gradienti alle densità desiderate (90%, 70%, 50%, 40%). Si stratifica quindi 1 ml di ogni gradiente, dal più pesante al più leggero, e sopra tale colonna si pone un volume di liquido seminale non superiore al volume della colonna stessa. Si centrifuga poi per 20' a 1500 RPM (rotazioni per minuto). Il pellet che giace sul fondo della provetta è poi recuperato e risospeso in 3-4 ml di terreno di coltura; si centrifuga per 5' allo scopo di eliminare eventuali residui di Percoll dagli spermatozoi (questo passaggio può essere ripetuto due volte); eliminato il surnatante, si risospende poi il pellet in un volume di terreno noto. Le prime metodiche descritte prevedevano l'utilizzo di colonne di 5 o 6 gradienti mentre ora sono in uso metodiche che ne utilizzano 2 (90% - 40%) o al massimo 3 (90% - 70% - 50%): ciò ha il vantaggio di una maggior rapidità dal punto di vista tecnico e di una migliore efficacia nel recuperare un maggior numero di spermatozoi (minipercoll) 14. In pazienti con gravi alterazioni dei parametri seminali è consigliabile crioconservare il seme prima del tentativo FIVET, qualora non si trovassero spermatozoi nel campione a fresco il giorno del pick up ovocitario. È consigliabile il congelamento dei gameti anche a pazienti oncologici prima di chemio- o radioterapie. Gli spermatozoi possono derivare da un eiaculazione spontanea o da un Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 14

15 prelievo dai testicoli o dagli epididimi e possono essere congelati e conservati. Studi hanno dimostrato che una conservazione fino a 30 anni degli spermatozoi non ne altera la qualità. Crioconservazione dei gameti e degli embrioni Le strategie di congelamento mirano a preservare i gameti che la fecondazione in vitro solitamente produce in eccesso, nel tentativo di limitare la ripetizione di terapie di stimolazione ovarica. Il congelamento degli embrioni da oltre un ventennio rappresenta una realtà ben consolidata in molte parti del mondo. Gli ovociti prelevati e fecondati nell ambito di un ciclo di FIVET o di ICSI sovrannumerari possono essere congelati. Il ricorso alla crioconservazione è tuttavia consigliabile soltanto per gli embrioni qualitativamente buoni, per i quali l esperienza indica un 70-80% di probabilità di sopravvivenza dopo lo scongelamento. Le probabilità di successo di iniziare una gravidanza mediante transfer di un embrione crioconservato sono pari al 25 30% per ciclo. Il congelamento degli ovociti che invece eticamente non pone alcun problema, sembra penalizzato da fattori essenzialmente di natura biologica come la dimensione cellulare, l architettura citoscheletrica e la presenza dei microtubuli del fuso meiotico; queste sono strutture altamente sensibili alle variazioni di temperatura. Prerogativa del congelamento di ovociti ed embrioni è stata da sempre l utilizzazione di basse concentrazioni di crioprotettori, abbinata sostanzialmente a metodi di congelamento lento o ultrarapido e scongelamento rapido. Un metodo alternativo al congelamento lento è oggi rappresentato dalla vitrificazione. Ciò che distingue la vitrificazione dalle altre tecniche sono l esposizione cellulare a elevate concentrazioni di crioprotettore (5-7 M) e l elevata velocità di congelamento che serve a minimizzare gli effetti tossici dello stesso. Risultati della PMA I risultati delle tecniche di PMA ovviamente sono variabili da centro a centro ma attualmente sono consultabili i dati riportati dal Registro Nazionale del In Italia sono state ottenute gravidanze; il 95% di queste sono state ottenute con tecniche a fresco. La percentuale di gravidanza per embryo transfer è stata del 25,5%. Le percentuali di gravidanza per ciclo iniziato sono state stratificate per età e sono riportate in Tabella 5. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 15

16 Tabella 5. Percentuali di gravidanza su cicli iniziati da tecniche a fresco, secondo la tecnica utilizzata per classi di età (Registro nazionale 2007) Classi di età Cicli iniziati % di gravidanze FIVET ICSI FIVET ICSI ,2 30, ,5 26, ,3 19, ,4 9, ,6 10, ,6 5, , ,1 1,5 Totale ,9 19,8 Rischi della PMA I rischi della PMA sono essenzialmente legati a tre situazioni: la sindrome da iperstimolazione ovarica (SIO), le gravidanze multiple e le gravidanze extrauterine. La sindrome da iperstimolazione ovarica L induzione della superovulazione, in particolare con gonadotropine, può provocare una sindrome da iperstimolazione ovarica (SIO) dovuta alla crescita di numerosi follicoli ovarici e all elevata concentrazione sierica di estrogeni. Caratteristica della SIO è l aumento volumetrico delle ovaie con presenza di numerose formazioni cistiche e la fuoriuscita di liquidi dal distretto vascolare al cosiddetto terzo spazio ; conseguenza di ciò è la deplezione del volume intravascolare con emoconcentrazione. L incidenza della SIO è variabile tra lo 0,1 e il 4%; considerando l alto numero d induzioni dell ovulazione e della superovulazione praticate ogni anno, il numero assoluto di casi di SIO è numericamente importante. Il rischio di SIO può essere però ridotto (fino all 1% della popolazione) se è eseguito un corretto monitoraggio della crescita follicolare 15. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 16

17 Le gravidanza multiple L induzione della superovulazione e le procedure di PMA portano a un aumentato rischio di gravidanze multiple, rischio pari al 20-25% rispetto al 2% circa di multiparità delle gravidanze spontanee. Ciò avviene, in caso d inseminazioni intrauterine, se sono presenti più follicoli e, in caso di FIVET e ICSI, se più embrioni sono trasferiti nella cavità uterina. Obiettivo della PMA deve essere la gravidanza possibilmente singola; la gravidanza multipla, anche se gemellare, deve essere considerata una gravidanza più a rischio, sia per la madre, sia per i feti. Tali rischi, soprattutto per i feti, crescono con il crescere dell ordine della gravidanza multipla. Allo scopo di evitare gravidanze multiple in percentuale eccessiva, alcuni centri non eseguono l inseminazione quando siano presenti più di 3-4 follicoli di diametro medio superiore ai 15 mm e non trasferiscono dopo FIVET o ICSI più di 2-3 embrioni. Trasferire più di 3 embrioni è dimostrato non incrementare le percentuali totali di gravidanza ma solo la quota di concepimenti multipli 16. Le gravidanze extrauterine Infine la PMA sia in vivo, sia in vitro, aumenta il rischio di una gravidanza con impianto al di fuori dell utero, portandolo al 5% circa rispetto allo 0,5% delle gravidanze spontanee. Ciò può essere spesso messo in relazione a una patologia tubarica nota o misconosciuta 17. Counselling delle coppie infertili La procreazione medicalmente assistita (PMA) svolge un ruolo centrale nel trattamento della coppia infertile. In questa sezione vengono illustrate nel dettaglio queste tecniche. In questo ambito, è significativo soprattutto sottolineare l importanza di non trascurare soluzioni alternative. La crescente probabilità di successo della PMA ha determinato che altri trattamenti siano stati ridotti. In realtà, nonostante l elevata probabilità di successo di queste tecniche, la compliance dei pazienti rimane bassa. È stato stimato che il 30-50% delle coppie che iniziano un percorso di PMA abbandona il programma di trattamento (in genere di almeno 3 cicli) prima del termine. A queste deve essere aggiunta una quota di coppie, numericamente non ben definita ma verosimilmente importante, che non inizia nemmeno il percorso. In questo contesto, è importante ricordare che le coppie non vivono la PMA come la vera soluzione. Ovviamente, non è sempre possibile una medicina che corregga il difetto, restituendo la coppia alla normalità e quindi alla possibilità di un concepimento spontaneo. Non bisogna però dimenticare che tale soluzione deve rimanere l obiettivo primario. Inoltre, un trattamento in grado di incrementare anche solo modestamente la probabilità di gravidanza spontanea può essere d interesse perché il suo effetto è additivo a quelli della PMA. Ovviamente, tali trattamenti devono avere un bilancio tra benefici ed effetti indesiderati accettabile. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 17

18 Infine, è utile tenere in considerazione che questi trattamenti non sono mutuamente esclusivi con la PMA. In altre parole, se un trattamento non esita in una gravidanza, si può in un secondo tempo passare alla PMA. Si parla in questo caso di progressività dei trattamenti. Peraltro, la legislazione correntemente in vigore (Legge 40/2004) invita proprio a un approccio di questo tipo. La PMA dovrebbe essere prescritta dopo che altri trattamenti sono risultati inefficaci (vedi Tabella 6). Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 18

19 Tabella 6. Trattamenti dell'infertilità, esclusa la PMA Patologia Intervento Commento sull efficacia Donna Ipogonadismo ipogonadotropo Dieta, counselling psicologico Sicuramente efficace Stimolazione dell ovulazione Sicuramente efficace Sindrome policistico (PCO) dell ovaio Stimolazione ovulazione Metformina Sicuramente efficace Efficacia dubbia Miomi intramurali o sottosierosi Ovarian drilling Possibile efficacia, ma discussa Miomectomia Efficacia maggiore per miomi con diametro 5 cm Miomi sottomucosi Miomectomia Sicuramente efficace Polipi endometriali Polipectomia Sicuramente efficace Endometriosi Asportazione lesioni Efficace per malattia al I-II stadio Malattia infiammatoria pelvica (PID) cronica Lisi salpingoplastica, salpingoneostomia aderenze, Efficacia modesta. Rischio di gravidanza extrauterina dopo l intervento. Uomo Ipospermatogenesi Stimolazione con gonadotropine Efficace ma solo in caso di ipogonadismo ipogonadotropo Varicocele Correzione chirurgica Efficacia dubbia Sterilizzazione Rianastomosi Efficacia moderata Ne consegue che le coppie che afferiscono a tecniche di primo livello hanno le seguenti indicazioni: fattore maschile lieve, fattore anovulatorio ed eziologia sconosciuta; le indicazioni a tecniche di secondo livello sono la ridotta riserva ovarica, il fattore maschile grave, il fattore tubarico e l endometriosi di III e IV stadio. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 19

20 La consulenza di una coppia sterile deve tenere conto in primo luogo dell aspetto psicologico della coppia. Al centro dell attenzione del medico deve esserci la qualità della vita dei pazienti e non solo la patologia. Esistono diversi studi sulla relazione tra le tecniche di fecondazione in vitro e lo stress delle coppie prima e dopo i trattamenti. Nel 2005 in Italia è stato condotto uno studio molto ampio su 1000 coppie sottopostesi a FIVET. Tutte le pazienti e i rispettivi partner sono stati intervistati secondo la Health Survey Short Form (SF-36), questionario sulla qualità della vita che comprende diverse voci: funzioni fisiche, limitazioni della vita sociale, dolore fisico, salute generale, vitalità, attività sociale, limitazione dell aspetto emotivo e salute mentale. Il questionario è stato completato prima e dopo il trattamento. Ne è risultato che il profilo soggettivo di salute generale delle coppie poche settimane prima della FIVET non differiva da quello della popolazione generale e, in secondo luogo, la necessità di svolgere tecniche di PMA non influiva sullo stato soggettivo di salute. Tuttavia, una lunga durata d infertilità e precedenti fallimenti di PMA influivano negativamente sullo stato soggettivo psicologico 18. A questo proposito assume rilievo il concetto di drop-out, cioè di abbandono delle terapie. Sembra che la causa principale di abbandono delle terapie da parte delle pazienti sia infatti il calo emotivo dovuto al fallimento. È riportato in letteratura che il tasso di drop-out medio sia del 50% 18. In Europa i motivi principali sono principalmente la demoralizzazione nell affrontare un nuovo ciclo FIVET dopo un fallimento a causa di una cattiva prognosi decretata dai medici e l impossibilità di pagare le cure. In Italia e nei paesi in cui è possibile il rimborso da parte del Sistema Sanitario Nazionale sembra che il tasso totale di drop-out sia minore. Ci sono poi fattori addizionali che incrementano la possibilità di abbandono da parte delle coppie, quali l età del partner, la parità e i livelli pre-esistenti di ansia e depressione 19. Il fattore età e/o la presenza di patologie compromettenti la riserva ovarica influenzano lo stato depressivo in modo negativo a causa della maggiore probabilità di non raggiungere l ultimo step della terapia, l embryo transfer. Il non raggiungimento del trasferimento degli embrioni è correlato al peggioramento dello stato emotivo delle pazienti e di conseguenza a un più elevato rischio di drop-out 20. Pertanto è fondamentale prestare una consulenza corretta alle coppie, informandole adeguatamente. I punti da chiarire sono: la progressività dei trattamenti; Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 20

21 la necessità di eseguire le terapie a domicilio con un monitoraggio ecografico giornaliero e prospettando di conseguenza il tempo necessario alle cure; le esatte percentuali di successo delle tecniche per ciclo, per pick up ovocitario e per embryo transfer; la possibilità di fallimento al primo ciclo, con conseguente necessità di svolgere ulteriori tentativi; la legislazione italiana attualmente vigente (Legge 40/2004). Legge 40/2004 Il 10 Febbraio 2004 il Parlamento italiano ha promulgato la legge 40/2004 con lo scopo di regolamentare le tecniche di procreazione medicalmente assistita. La legge 40/2004 è stata deliberata da una commissione ministeriale. Lo scopo delle linee guida delineate è stato quello di dare norme tecniche ai medici afferenti a tutti i Centri di Sterilità Italiani. Inoltre, l Istituto Superiore di Sanità ha stabilito un Registro Nazionale in cui tutti i Centri afferenti devono fornire i dettagli dei cicli FIVET eseguiti da tutti i pazienti afferenti alle terapie. Il Registro Nazionale ha il fine di controllare strettamente l osservazione della rigida regolamentazione della Legge. Per quanto riguarda la normativa nello specifico, l art.1 della Legge innanzitutto ha previsto che la PMA sia applicata solo a quelle coppie che hanno una diagnosi di sterilità. La legge inoltre ha invitato a un approccio progressivo; pertanto la PMA dovrebbe essere prescritta dopo che altri trattamenti sono risultati inefficaci. Dopo questa affermazione iniziale la legge ha previsto una lunga serie di proibizioni e divieti. La legge tutela l embrione; di conseguenza: - ha vietato la produzione di embrioni sovranumerari; - ha permesso la possibilità di fertilizzare al massimo 3 ovociti; - ha obbligato a trasferire tutti gli embrioni ottenuti; - ha consentito il congelamento dagli ovociti e degli spermatozoi; - ha vietato la diagnosi pre-impianto. La legge inoltre ha vietato: - la donazione degli ovociti; Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 21

22 - la donazione degli spermatozoi. Le limitazioni introdotte dalla legge 40/2004 hanno ridotto la possibilità per i medici di adattare la tecnica secondo i casi e hanno limitato in parte anche il successo stesso della fecondazione in vitro. Gli oppositori alla legge 40/2004 hanno sostenuto dunque che fossero i medici e le donne, secondo i casi clinici e le proprie considerazioni etiche, a dovere e poter decidere quali tecniche adottare. Le restrizioni della legge hanno determinato in Italia un fenomeno definito turismo procreativo, termine che descrive la scelta, da parte di coppie la cui condizione medica lascia solo pochissime speranze di soluzione in Italia, a seguito delle restrizioni introdotte, di rivolgersi a ospedali e strutture sanitarie straniere ubicate in Paesi con legislazioni meno restrittive riguardo alla FIVET, per aumentare le possibilità di una gravidanza. Si stima, confrontando dati statistici fra il periodo e , che questo fenomeno abbia triplicato, nel Canton Ticino, il numero di coppie italiane che si sono rivolte a istituti svizzeri per godere di servizi medici relativi a queste problematiche, non fruibili in Italia. Il 1º aprile 2009, i commi 2 e 3 dell'articolo 14 sono stati dichiarati parzialmente illegittimi con la sentenza n. 151 della Corte costituzionale. In particolare, il comma 2 è stato dichiarato illegittimo laddove prevedeva un limite nella produzione di embrioni comunque non superiore a tre e laddove prevede l'obbligo di un unico e contemporaneo impianto. Il comma 3, che prevedeva di poter crioconservare gli embrioni qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione, è stato dichiarato illegittimo nella parte in cui non prevedeva che il trasferimento di tali embrioni, da realizzare non appena possibile, debba essere effettuato anche senza pregiudizio per la salute della donna. Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 22

23 Bibliografia 1. Te Velde ER, Eijkemans R, Habbema HD. Variation in couple fecundity and time to pregnancy, an essential concept in human reproduction. Lancet Jun 3;355(9219): Evers JL. Publication bias in reproductive research. Hum Reprod Oct;15(10): Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima ST, Coutifaris C, Carson SA, Cisneros P, Steinkampf MP, Hill JA, Xu D, Vogel DL; National Cooperative Reproductive Medicine Network. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med Nov 8;345(19): Pandian Z, Akande VA, Harrild K, Bhattacharya S. Surgery for tubal infertility. Cochrane Database Syst Rev Jul 16;(3):CD Vercellini P, Somigliana E, Viganò P, Abbiati A, Daguati R, Crosignani PG. Endometriosis: current and future medical therapies. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol Apr;22(2): Epub 2007 Nov 26. Review. 6. Vercellini P, Crosignani PG, Somigliana E, Berlanda N, Barbara G, Fedele L. Medical treatment for rectovaginal endometriosis: what is the evidence? Hum Reprod Oct;24(10): Cohlen BJ, Vandekerckhove P, te Velde ER, Habbema JD. Timed intercourse versus intrauterine insemination with or without ovarian hyperstimulation for subfertility in men. Cochrane Database Syst Rev. 2000;(2):CD Review. Update in: Cochrane Database Syst Rev. 2007;(3):CD Antinori M., Licata E., Dani G., Cerusico F., Versaci C., d Angelo D., Antionri S. Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection: a prospective randomized trial. Reprod Biomed Online 2008 Jun;16(6): Daya S. Gonadotropin releasing hormone agonist protocols for pituitary desensitization in in vitro fertilization and gamete intrafallopian transfer cycles. Cochrane Database Syst Rev. 2000;(2):CD Modulo 1 Counseling e corretta comunicazione alla coppia sterile Sanitanova - Tutti i diritti riservati 23