Introduzione al corso

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1 Laurea Triennale in Tecniche di Laboratorio Biomedico Tecniche di laboratorio in neurochimica e neuroimmunologia Massimiliano Castellazzi Introduzione al corso

2 Articolazione delle lezioni Lezione 1. Cenni di immunologia generale e autoimmunità. Lunedì 15 maggio 16:30-18:30 Lezione 2. Il liquido cerebrospinale (LCS) e la barriera ematoencefalica. Mercoledì 17 maggio 16:30-18:30 Lezione 3. L'analisi del LCS nei disordini neurologici. Venerdì 19 maggio 14:30-16:30 Lezione 4. L'analisi del LCS nella diagnosi di sclerosi multipla. Lunedì 22 maggio 14:30-16:30 Lezione 5. L'immunochimica. Lunedì 22 maggio 16:30-18:30 Lezione 6. Malattie paraneoplastiche (Dott.ssa Elena Contaldi) e Autoanticorpi in neurologia. Martedì 23 maggio 14:30-16:30 Lezione 7. La ricerca traslazionale in neurologia: biomarkers, biobanche e ricerca clinica. Martedì 23 maggio 16:30-18:30 Lezione 8. Tecniche avanzate e preparazione prove pratiche. Giovedì 25 maggio 14:30-18:30

3 Articolazione delle esercitazioni Prove pratiche in laboratorio Gruppo 1: Lunedì 29 maggio 14:30-18:30 - preanalitica, isoelettrofocusing Martedì 30 maggio 14:30-18:30 - immunoblotting Mercoledì 31 maggio 14:30-18:30 - interpretazione dei risultati, refertazione Gruppo 2: Lunedì 5 giugno 14:30-18:30 - preanalitica, isoelettrofocusing Martedì 6 giugno 14:30-18:30 - immunoblotting Mercoledì 7 giugno 14:30-18:30 - interpretazione dei risultati, refertazione Ultima lezione Giovedì 8 giugno 14:30-18:30 - discussione metodiche Esame, test a risposta multipla: data da definire

4 La Neurochimica Ramo della biochimica che applica i propri metodi allo studio delle strutture e del funzionamento del sistema nervoso. Nell ambito delle scienze neurologiche la neurochimica rappresenta una corrente di studi che si è rivelata particolarmente fertile di risultati, grazie allo sfruttamento dei mezzi e delle tecniche d indagine comuni alle altre scienze biologiche (autoradiografia, centrifugazione frazionata, cromatografia, microscopia elettronica, microscopio a scansione) e alla messa a punto di tecniche sue proprie che, al riparo da artefatti, permettono la dimostrazione degli stessi componenti labili e, grazie alla loro rapidità, di cogliere il processo fisiologico nel momento critico voluto. Per quanto concerne i risultati possono essere citate le acquisizioni in tema di mediazione chimica, comprendenti sia l individuazione dei singoli mediatori e delle loro linee metaboliche, sia le modalità e i livelli della loro azione, quelle concernenti i processi chimici che si svolgono nelle giunzioni neuromuscolari, nei recettori e in particolare nei fotorecettori, le osservazioni sul substrato chimico dei meccanismi della memoria e, nel campo della patologia, l interpretazione della patogenesi di alcune malattie quali l oligofrenia fenil-piruvica, il morbo di Wilson, o degenerazione epato-lenticolare, e il morbo di Parkinson.

5 La Neuroimmunologia Disciplina che ha lo scopo, nell ambito delle patologie neurologiche, di individuarne gli eventuali meccanismi patogenetici di origine immunitaria, e di sviluppare e validare, anche utilizzando la modellistica animale, terapie immunologiche per il trattamento delle malattie infiammatorie autoimmunitarie del sistema nervoso. In particolare, sono le malattie demielinizzanti e specialmente la sclerosi multipla, le neuropatie periferiche disimmuni e quelle da accumulo di amiloide, le malattie neuromuscolari e le sindromi neurologiche paraneoplastiche (encefalomielite, Encefalomieliti autoimmuni) a essere interessate dalle ricerche dei neuroimmunologi. Essi seguono due direzioni: individuazione di nuovi bersagli immunologici da colpire per ridurre l infiammazione e identificare nuove molecole neuroprotettive per ridurre il danno neurologico permanente determinato dalla perdita neuronale. Dall ultimo decennio del 20 sec. sono stati individuati sistemi di terapia genica per il trasporto di molecole antinfiammatorie e neuroprotettive nell SNC e sono stati identificati nuovi bersagli terapeutici immunologici, quali quelli delle caspasi (proteasi coinvolte nella fuoriuscita dalla cellula di molecole proinfiammatorie, come le citochine).

6 Caratteristiche dei test di laboratorio Malattia Presente Assente Test Positivo Negativo VERI POSITIVI (A) FALSI NEGATIVI (C) FALSI POSITIVI (B) VERI NEGATIVI (D) Valore predittivo del test positivo = A / (A + B) (%) Valore predittivo del test negativo = D / (C + D) (%) Sensibilità = A / (A + C) (%) Specificità = D / (B + D) (%) - La sensibilità di un test è la sua capacità di individuare una malattia quando essa sia presente. Se un test non è sensibile, mancherà di individuare la malattia in qualche soggetto malato, e questi individui appariranno nella cella C. - La specificità di un test si riferisce alla sua capacità di individuare l'assenza di malattia quando la malattia non è presente. Se un test non è specifico indicherà falsamente la malattia in soggetti non malati, e questi appariranno nella cella B. - Valore predittivo del test positivo: la probabilità di essere malati dei soggetti risultati positivi al test. - Valore predittivo del test negativo: la probabilità di essere sani dei soggetti risultati negativi al test.

7 Caratteristiche dei test di laboratorio Malattia Presente Assente Test Positivo Negativo VERI POSITIVI (A) FALSI NEGATIVI (C) FALSI POSITIVI (B) VERI NEGATIVI (D) Valore predittivo del test positivo = A / (A + B) (%) Valore predittivo del test negativo = D / (C + D) (%) Sensibilità = A / (A + C) (%) Specificità = D / (B + D) (%) - Si definisce Rapporto di verosimiglianza positivo (RV+) (likelihood ratio di un test positivo) il rapporto fra (sensibilità) e (1 - specificità): RV+ = [A / (A+C) ] / [B /(D+B) ]. RV+ è il rapporto fra la probabilità che un malato risulti positivo e la probabilità che un sano risulti positivo. In altri termini, in caso di risultato del test positivo, è RV+ volte più probabile che il soggetto sia malato che sano. - Si definisce Rapporto di verosimiglianza negativo (RV-) (likelihood ratio di un test negativo) il rapporto fra (1 - sensibilità) e (specificità): RV- = [C / (A+C) ] / [D /(D+B) ]. RV- è il rapporto fra la probabilità che un malato risulti negativo e la probabilità che un sano risulti negativo. In altri termini, in caso di risultato del test negativo, è RV- volte più probabile che il soggetto sia malato che sano.

8 Caratteristiche dei test di laboratorio Stima della sensibilità e specificità I valori di sensibilità e specificità di un test vengono calcolati attraverso esperimenti eseguiti su un campione. Lavorando su un campione esiste il problema della variabilità dovuta al caso. Perciò soprattutto quando il campione studiato è piccolo, è opportuno calcolare l'intervallo di confidenza (es. intervallo di confidenza 95%), che serve a quantificare la precisione della stima ottenuta riguardo ai valori di sensibilità e specificità. Ezio Bottarelli

9 Caratteristiche dei test di laboratorio Stima della sensibilità e specificità I valori di sensibilità e specificità di un test vengono calcolati attraverso esperimenti eseguiti su un campione. Lavorando su un campione esiste il problema della variabilità dovuta al caso. Perciò soprattutto quando il campione studiato è piccolo, è opportuno calcolare l'intervallo di confidenza (es. intervallo di confidenza 95%), che serve a quantificare la precisione della stima ottenuta riguardo ai valori di sensibilità e specificità. Ezio Bottarelli

10 Caratteristiche dei test di laboratorio PRECISIONE - Ripetibilità (variazione intra-saggio): stesso metodo su campioni identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa sessione analitica). Ad esempio ELISA: stessa piastra = stessa calibrazione; X replicati. Si calcola il coefficiente di variazione (CV) = deviazione standard (DS) / media (m) - Precisione intermedia (variazione inter-saggio): stesso metodo su campioni identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura ma in intervalli di tempo lunghi (diverse sessioni analitiche con possibilità di cambiamento del lotto dei reattivi e dei consumabili). Ad esempio in ELISA: kit diversi (diverso numero di lotto) = calibrazioni diverse; giorni diversi. Si calcola il CV = DS/m - Riproducibilità (confronto inter-laboratorio): laboratori diversi; operatori diversi; apparecchiature diverse; misure in tempi differenti (norma UNI CEI EN ISO/IEC 17043:2010).