Alterazioni indotte da variazioni del vettore gravità a livello cellulare e tissutale

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1 INRCA Alterazioni indotte da variazioni del vettore gravità a livello cellulare e tissutale M.A. Masini1, B. Uva1, F. Ricci2, P.Prato1,Strollo3, 1Dipartimento di Biologia, University of Genova, Italy, 2 ENEA C.R. Casaccia Roma Italy 3Unita Endocrinologia INRCA & Università di Roma La Sapienza, Italy, XX Convegno dell Associazione Italiana di Medicina Areonautica e Spaziale (AIMAS) Firenze 5-7 settembre 2007

2 INTRODUZIONE I cosmonauti sono esposti ad ipergravità al momento del lancio e dell atterraggio ed a gravitò vicino allo zero durante il volo. Da tempo sono state descritte alterazioni a carico di molti sistemi funzionali sopratutto come conseguenza della microgravità e si stanno studiando adeguate contromisure. Tuttavia pochi sono gli studi che cercano di risalire a livello tissutale, cellulare e molecolare per interpretare queste alterazionni fisiologiche ed intervenire alla radice con adeguate contromisure. Sono infatti state osservate disorganizzazioni a livello citoscheletrico in linfociti e macrofagi, che potrebbero spiegare le alterazioni osservate a livello del sistema immunitario e simili alterazioni sono state osservate in cellule di diversa provenienza poste in coltura ed esposte, in esperimenti a terra, a variazioni del vettore gravità. M. Cogoli-Greuteret al., J. Gravit. Physiol. (1994) M. Lewis et al., Faseb J. (1998) I. Walther et al., Eur. J. Med.Res.4 (1999) B.M. Uva ei al., Brain Res. 934 (2002a) B.M. Uvaet al., J. Histochem. (2002b) Uva et al., Acta Astronautica (2006)

3 Scopo delle ricerche Scopo delle nostre ricerche è di studiare, con esperimenti condotti a terra, l effetto delle variazioni del vettore gravità (ipergravità e microgravità simulata) su astrociti, cellule testicolari e piccoli blocchi di tessuto testicolare posti in coltura e di individuare possibili contromisure che possano ridurre i fenomeni di alterazione osservati a livello cellulare.

4 Materiali - Linea cellulare C 6 da astroglioma di ratto, - Cellule testicolari (BS PRC 57/STe, cariotipo 2n, linea cellulare primaria da testicolo di maiale prepubere tripsinizzato, contenente cellule del Sertoli, cellule germinali, cellule mioidi e cellule di Leydig -Piccoli blocchi di tessuto testicolare da ratti wistar adulti -Le cellule sono state coltivate in DMEM con aggiunta o meno di ioni bivalenti (Ca e Mg)

5 MEZZO DI COLTURA DMEM +Ca2+ (5µg/ml) + Sali minerali (10 mg/ml) +Mg2+ (0,70mg/ml)

6 Le cellule sono state seminate sul lato rimovibile delle flask on a slide. Flask on a slide Le cellule ed I tessuti sono stati sottoposti ad ipergravità (2,5 G) usando una iperfuga ed a microgravità simulata usando un Dutch Space desktop three Dimensional Random Positioning Machine (3DRPM): rotazioni per 30,1h, 24h e 32h a 56 gradi/sec microgravità simulata 10-6G Iperfuga 3DRPM

7 Dopo le rotazioni, campioni di cellule sono stati trattati per osservazioni al microscopio elettronico a scansione od a trasmissione (SEM, TEM). Altre cellule ed I tessuti sono stati fissati con paraformaldeide 4% Dopo la fissazione I blocchi di tessuto sono stati sezionati (5 mµ) Cellule e sezioni di tessuto sono stati sottoposti ad analisi istologica (ematossiliona-eosina) o ad immunoistochimica utilizzando gli anticorpi elencati nella prossima diapositiva.

8 Anticorpi utilzzati: Ab- α tubulina Ab-proteine della membrana mitocondriale interna (AMA) Ab- Na+/K+ATPase Ab- Na+/K+/Cl- cotransporter NKCC1 T4 Ab- 3β-idrossisteroido deidrogenasi (3βHSD, human type I) Ab- 17β-idrossisteroido deidrogenasi (17βHSD, type I A-15) Ab-caspasi 7 Ab-Heat Shock Proteins (HSPs) 25/27, 70 La F actina è stata visualizzata con la falloidina La frammentazione del DNA è stata visualizzata con il metodo TUNEL (terminal dutpnick end labeling in situ cell death fluorescence detection kit). Le cellule sono state osservate con un microscopio convenzionale o confocale.

9 Risultati I risultati sono stati suddivisi come segue: -Osservazioni delle eventuali alterazioni in rotazioni da 15 ad 1h -Osservazioni dopo rotazioni da 1h a 32h -Osservazioni di cellule in coltura con aggiunta nel mezzo di ioni bivalenti

10 ALTERAZIONI ENTRO 1h di ROTAZIONI IN RPM ED IN IPERFUGA Citoscheletro: microtubuli 30 µg G Astrociti 30min µg 30 µg Cellule di Leydig

11 ALTERAZIONI ENTRO 1h di ROTAZIONI IN RPM ED IN IPERFUGA Alterazioni mitocondriali 30 µg G

12 Osservazioni ultrastrutturali della membrana plasmatica e delle alterazioni nei mitocondri in astrociti Plasma membrane 30 µg Mitochondria 30 µg

13 Na+K+/ATPasi astrociti 30 µg STe: cellule di Laydig 30 µg

14 Na+/K+/Cl- cotransporters astrociti 30 µg

15 3βHSD nelle cellule di Leydig 3βHSD 30 µg 1h µg

16 17βHSD nelle cellule di Leydig 30 µg

17 Apoptosi in astrociti APOPTOSIS TUNEL 30 µg Cellule contratte Caspase 7 30 µg SEM

18 DOPO 1h DI ROTAZIONI IN RPM ED IN IPERFUGA Mirotubuli astrociti Cellule di Laydig 32h µg 32h µg astrociti astrociti 1h 2.5 G 20h 2.5G

19 DOPO 1h DI ROTAZIONE Membrana plasmatica 24h µg Mitocondri 24hµG

20 Na+K+/ATPasi 24h µg Astrociti 32h µg Cellule di Laydig Na+/K+/Cl- cotransporters Astrociti di nuova formazione 24h µg

21 3βHSD 24h µg 17βHSD 32h µg

22 1h E 24h DI ROTATIONI IN RPM NEL TESTICOLO 1h µg 30 µg 24h µg

23 ENTRO 1h DI ROTAZIONE 3βHSD 3βHSD 30 µg 17bHSD 30 µg

24 ENTRO 1h DI ROTAZIONE Caspasi 30min µg TUNEL

25 SINTESI DI HSPs DOPO UN ORA IN MICROGRAVITA E 15 IN IPERGRAVITA astrociti testicolo

26 AGGIUNTA DI Ca2+ AL MEZZO DI COLTURA Microtubuli in astrociti 1h µg

27 AGGIUNTA AL MEZZO DI COLTURA DI Mg2+ Microfilamenti 24h µg Microtubuli 24h µg

28 Percentuale di cellule con microtubuli ben organizzati MicroG Control +Ca 2+ +Mg 2+

29 Percentuale di cellule in mitosi +Mg 2+ Control +Ca 2+

30 RISULTATI Dopo 1h in microgravità simulata: -I microtubuli ed i microfilamenti appaiono danneggiati. -L aggiunta di integratori contenenti sali minerali al mezzo di coltura protegge il citoscheletro. -Una analisi più puntuale ha dimostrato che l aggiunta di Ca2+ e Mg2+ aumenta il numero delle cellule ben organizzate ed il numero delle mitosi nelle colture.

31 DISCUSSIONE Gli esperimenti hanno confermato le gravi alterazioni precedentemente osservate nella organizzazione citoscheletrica delle cellule in coltura sottoposte a microgravità simulata. I presenti risultati hanno dimostrato che l aggiunta di ioni calcio e magnasio al mezzo di coltura protegge l integrità delle cellule. -Anche se la somministrazione di calcio può aumentare il rischio di calcoli renali, non va dimenticato che il Sistema Nervoso Centrale dipende dal calcio per un buon funzionamento. -La somministrazione del calcio nella dieta deve perciò essere attentamente dosata durante I voli spaziali.