Tecnologie innovative nella lotta alle frodi un approccio multidisciplinare Parte seconda

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1 FOOD AUTHENTICITY: creazione di un network europeo per il contrasto alle frodi alimentari. Torino, 18/10/17 Tecnologie innovative nella lotta alle frodi un approccio multidisciplinare Parte seconda Dr.ssa Giovanna Esposito S.S. Genetica ed Immunobiochimica

2 Agenda 1. Introduzione alla spettrometria di massa 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) 3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati) 4. Ricerca dei composti polari in oli di frittura (metodo accreditato) 5. Ricerca acido lattico in uova ed acido 3-idrossibutirrico in ovoprodotti (metodi accreditati)

3 1. Introduzione alla spettrometria di massa Perchè la spettrometria di massa? Nell ambito della sicurezza alimentare, il controllo delle materie prime e dei prodotti finiti richiede metodi sempre più affidabili, veloci e poco costosi. Determinazione del peso molecolare Delucidazione della struttura molecolare Identificazione di componenti di una miscela Indagini quantitative Indagini di screening Analisi targeted o untargeted Intervallo di PM fino a centinaia di kda Sensibilità dell ordine delle picomoli o inferiore Acquisizione veloce dei dati Interfacce con metodi separativi Alta e bassa risoluzione

4 1. Introduzione alla spettrometria di massa Cosa fa lo spettrometro di massa accoppiato alla DSA? produce ioni a temperatura ambiente e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Crea Separa Applicazioni Misura Chimica alimentare Chimica forense Chimica clinica Tossicologia Ricerca contaminanti Risoluzione Accuratezza 5 ppm Rapidità dell analisi Riduzione dei costi

5 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Frodi alimentari ricercate Aggiunta illecita di coloranti vietati (Sudan I-IV) in matrici alimentari Stato di freschezza/degradazione dei prodotti ittici Distinzione tra allevato/pescato, contraffazione dei prodotti ittici Identificazione Oli/etichettatura DSA

6 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) SUDAN I-IV I coloranti Sudan sono composti solubili nei grassi caratterizzati da azo-gruppi (-N=N-). Essi sono metabolizzati in composti che agiscono con il DNA e possono produrre effetti cancerogeni, pertanto sono VIETATI Sudan I C16H12N2O Sudan III C22H16N4O Sudan II C18H16N2O Sudan IV C24H20N4O L'aggiunta di sostanze che migliorano o mascherano l'aspetto dei cibi si configura come una frode commerciale e/o sanitaria.

7 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Le partite di peperoncino, curcuma, olio di palma importati in UE devono essere accompagnate da un rapporto di analisi che attesti l assenza di Sudan dyes. Decision 2003/460/EC; 2004/92/EC; 2005/402/EC Allerte SUDAN Reggio Emilia: ritirato olio di palma del Ghana con colorante cancerogeno Sudan IV. Scatta allerta in Europa ( 2015, il Fatto alimentare)

8 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Preparazione dei campioni fortificati (aggiunta di una concentrazione nota di colorante) SUDAN I-IV Estrazione Acquisizione in positivo [M+H] + Estrazione dei Sudan 2 g di salsa + 2 ml n-exane 2 g di olio di palma + 2 ml acetonitrile 0.5 g di peperoncino + 2ml acetonitrile TIC: Corrente ionica totale EIC: Corrente ionica estratta

9 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Elaborazione ed interpretazione dello spettro di massa Ione pseudomolecolare Il picco dello ione pseudomolecolare è spesso accompagnato da altri picchi, in genere più deboli, a massa M+1, M+2, ecc. dovuti alle molecole contenenti isotopi degli elementi che le costituiscono. In questo caso ione [M+H]+1 è dovuto all'sotopo 13C Lista dei candidati che hanno composizione elementare e rapporti isotopici che soddisfano i criteri di ricerca e relativo errore e probabilità

10 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) EU LOD mg/kg 100 campioni analizzati Sciuto et al. J Food Prot Apr;80(4):

11 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Freschezza dei prodotti ittici La vendita di pesce in cattivo stato di conservazione rappresenta sia una frode commerciale che una possibile frode sanitaria. Ammine biogene possibile marker? Istamina Trimetilammina C5H9N3 C3H9N C4H12N2 C5H14N2 Attualmente non ci sono limiti di legge sui quantitativi ammessi per tali composti nei pesci. Per l'istamina il Regolamento (CE) n. 2073/2005 fissa il suo contenuto a ppm per questioni legati alle allergie.

12 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

13 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Prodotti della pesca studiati Orate, Polpi e Triglie 5g di pesce + 10ml MeOH:H2O (50:50) Preparazione dei campioni fortificati aggiunta di 0-30 mg/100g di TMA in campioni freschi Estrazione da T0 a T20 gg Acquisizione in positivo [M+H] +

14 peak area 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) 1,60E+008 1,40E+008 1,20E+008 1,00E+008 8,00E+007 6,00E+007 4,00E+007 2,00E+007 0,00E+000-2,00E+007 Linearity R² = 0, TMA (mg/100g) Analisi della TMA pesce fresco= 0-5 mg/100 g TMA pesce in corso di alterazione= 5-20 mg/100 g TMA avariato = >20 mg/100 g TMA Houet M.N.(2001) Webzine Sanità Pubblica Veterinaria n di campioni=60 provenienza= mercato ittico di Savona

15 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) 10% 20% 10% n di campioni =20 per specie provenienza = supermercati Torinesi pesce fresco= 0-5 mg/100 g TMA pesce in corso di alterazione= 5-20 mg/100 g TMA avariato = >20 mg/100 g TMA Houet M.N.(2001) Webzine Sanità Pubblica Veterinaria

16 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Pesce allevato/pescato La vendita di pesce allevato come pescato rappresenta una frode commerciale Gli acidi grassi sono un possibile marker? Acido Linoleico C18H32O2 Acido Docosaesaenoico (DHA) C22H32O2 Acido Arachidonico C20H32O2 Acido Eicosapentaenoico (EPA) C20H30O2

17 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Estrazione Acquisizione in negativo [M-H] - 5g di pesce + 10ml n-esano Prodotti ittici analizzati: Orate, Branzini

18 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Orate DHA/AA Risultati preliminari allevato pescato Branzini DHA/AA allevato pescato

19 3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati) Classificazione dell olio di oliva L'olio d'oliva è considerato uno dei prodotti agricoli italiani più importanti e rappresenta un prodotto di eccellenza importante sia in termini di benessere che di economia. Ottenuti con la sola spremitura meccanica a basse temperature (max 27 ) Olio extravergine di oliva: contenuto in acidità inferiore allo 0.8% Olio vergine di oliva: acidità fino al 2% Olio lampante e derivati olio ricavato dalle olive raccolte da terra quindi molto mature e con alto grado di acidità Olio di oliva vergine lampante: ottenuto mediante spremitura meccanica, presenta alta acidità o altri difetti organolettici Olio di oliva rettificato: prodotto della rettificazione chimica dell'olio lampante, volta ad eliminarne il contenuto in acidità; mancano totalmente i tipici sapori e profumi dell'olio d'oliva Olio di oliva: composto di oli raffinati e oli di oliva vergini con acidità non superiore all'1% (la direttiva non fissa una percentuale minima di olio vergine!)

20 3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati) Classificazione dell olio di oliva Ottenuti da lavorazioni chimiche o da scarti di lavorazione (deacidificazione, decolorazione, deodorazione) o con miscele di oli raffinati e vergini Olio di sansa e derivati La sansa è ciò che resta dopo l'estrazione dell'olio. Contiene ancora delle piccole quantità di olio. L'olio di sansa non è commestibile ma viene deodorato, decolorato e deacidificato e solo dopo l'aggiunta di una certa quantità di olio di oliva vergine diventa commestibile. Olio di sansa di oliva greggio: ottenuto dai residui della spremitura mediante solventi chimici Olio di sansa di oliva rettificato: olio di sansa greggio sottoposto ad una ulteriore rettificazione chimica Olio di sansa di oliva: olio di sansa rettificato miscelato con olio vergine

21 3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati) Le principali frodi sull olio olio extravergine che contiene oli raffinati, sia di oliva che di semi (taglio). Oli con tenori analitici non rispondenti ai requisiti previsti dai regolamenti comunitari (ad esempio un'acidità superiore ai limiti previsti per quella determinata categoria). Oli annacquati Oli di semi variamente colorati venduti come oli di oliva (soprattutto quello di mandorla e di arachide). Oli non corrispondenti all etichetta Le nuove frodi dell olio extra vergine: deodorazione, cambio di origine e di etichetta «Il Fatto alimentare»-2015

22 2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca) Metodo di screening per identificazione oli Diluizione Acquisizione in negativo [M-H] - 10ul di olio + 1ml isopropanolo Campioni analizzati -40 extravergini -20 oliva raffinati -15 semi picco ricorrente

23 3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca) Analisi semi-untargeted Acido Linoleico C18H32O2 X= molecola incognita Acido Oleico C18H34O2

24 3. Identificazione Oli di oliva (metodi accreditati) Metodi ufficiali per identificazione oli Il regolamento europeo n. 2568/91 (e s.m.i ) definisce le caratteristiche e i parametri dell'olio d'oliva e i metodi per la differenziazione degli oli, al fine di rilevare l'adulterazione. Prova di Wood Acidità libera Quantità di iodio Numero di perossidi Spettrofotometria Gascromatografia

25 3. Identificazione Oli di oliva (metodi accreditati) Metodi ufficiali per identificazione oli Determinazione dell'acidità Si misura mediante titolazione. Si esprime come percentuale in acido oleico (grammi di acido oleico in 100 grammi di campione) Determinazione del numero di perossidi Si misura mediante titolazione. Si esprime in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg di olio. Un aumento del numero di perossidi indica aumento dei processi ossidativi Ricerca di dieni e trieni con spettrofotometria UV Si misura mediante letture UV a 232 nm e 268 nm. Si esprime come coefficiente di estinzione specifica K Un aumento di tale valore può indicare fenomeni ossidativi.

26 3. Identificazione Oli di oliva (metodi accreditati) Metodi ufficiali per identificazione oli Limiti di riferimento REG UE 2095/2016 del 26/09/2016 GU L 326 del 01/12/2016 Categoria olio d oliva K ƛ 232 K ƛ 268 ΔK Acidità % N perossidi meq O 2 /Kg Olio d oliva extra vergine 2,50 0,22 0,01 0,8 Olio d oliva vergine 2,60 0,25 0,01 2,0 Olio d oliva lampante - > 2,0 Olio d oliva raffinato 1,25 0,16 0,3 Olio d oliva composto da oli d oliva raffinati e oli d oliva 1,15 0,15 1,0 vergini Olio di oliva di sansa greggio - Olio di oliva di sansa raffinato 2,00 0,20 0,3 Olio di sansa di oliva 1,70 0,18 1, PRISA/NAS % %

27 4. Ricerca dei composti polari in oli di frittura (metodo accreditato) OLIO DI FRITTURA Oli e grassi sottoposti a trattamenti termici Trasformazioni della loro composizione chimica Aumento dei composti polari COMPOSTI POLARI < 25 g/100 g Implicazione sanitaria

28 4. Ricerca dei composti polari in oli di frittura (metodo accreditato) TECNICHE DI ANALISI DEGLI OLI DI FRITTURA METODO UFFICIALE (Circ. MINSAN n.1): determinazione dei composti polari mediante cromatografia su colonna METODI RAPIDI DI SCREENING test colorimetrici 2017 A B A = 22 g/100 g B = 29 g/100 g 30%

29 5, Ricerca acido lattico in uova ed acido butirrico ovoprodotti (metodi accreditati) UOVA E OVOPRODOTTI Frodi commerciali in uova e ovoprodotti TMC > 28 gg lavate non dichiarate comunitarie o extra vendute come italiane falsa dichiarazione del metodo di allevamento falsa dichiarazione di biologico annacquamento miscela fresco-congelato uso di uova di specie diverse Frodi sanitarie in uova e ovoprodotti sporche e incrinate con residui di farmaci/ insetticidi (fipronil) lavate o refrigerate uso di sostanze per correggere il ph miscela vecchio / nuovo impiego di uova vecchie (alta carica batterica) o decomposte, non idonee al consumo

30 5. Ricerca acido lattico in uova ed acido butirrico ovoprodotti (metodi accreditati) Acido Lattico È il prodotto della fermentazione del lattosio ad opera dell'attività microbica. La sua concentrazione è correlata alla carica batterica totale e rappresenta un utile indicatore del buono stato di conservazione delle uova Acido 3-idrossi butirrico È indicativo dei prodotti del metabolismo microbico e della decomposizione; la determinazione della sua concentrazione serve a rilevare l'utilizzo di uova incubate o decomposte Il tenore di acido lattico delle materie prime impiegate non deve essere superiore a 1 g/kg di materia secca Il tenore di acido 3-OH-butirrico non deve essere superiore a 10 mg/kg di ovoprodotto pastorizzato allo stato di materia secca Regolamento 853/2004

31 Conclusioni Olio di frittura Identificazione oli Deterioramento uova Coloranti vietati in matrici alimentari Freschezza prodotti ittici Identificazione oli Pescato/allevato

32 S.S. Genetica ed Immunobiochimica Dr. Acutis Pier Luigi Dr.ssa Sciuto Simona Dr.ssa Dell Atti Luana Dr.ssa Maniaci Maria Grazia Sig.ra Veronese Ida Ringraziamenti Dr.ssa Tarasco Renata Dr.ssa Martucci Francesca