CLONAZIONE. CLONAZIONE DI UN GENE: TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE (vedi dispensa specifica su culture cellulari e tecnica DNA ricombinante)

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1 CLONAZIONE Clonazione ha almeno tre significati piuttosto differenti. Si può clonare un gene (farne una copia), clonare una cellula (farla riprodurre asessualmente) o clonare un organismo pluricellulare (inserendo il nucleo di una sua cellula in un ovocita ospite e facendo poi sviluppare lo zigote così ottenuto). CLONAZIONE DI UN GENE: TECNICA DEL DNA RICOMBINANTE (vedi dispensa specifica su culture cellulari e tecnica DNA ricombinante) Uno degli scopi della tecnologia del DNA ricombinante è la clonazione (cioè la produzione in molte copie) di un particolare gene allo scopo di poterlo analizzare o per poter ottenere grosse quantità del suo prodotto proteico. Questa tecnologia permette interventi mirati, che modificano in modo specifico solo i geni dei caratteri su cui si vuole agire. Inoltre, le metodologie odierne consentono di trasferire DNA non solo tra individui della stessa specie, ma anche tra specie diverse, spesso molto differenti l una dall altra. Si possono, per esempio, trasferire geni da un batterio a una pianta o introdurre in un batterio un gene proveniente da una cellula eucariotica. Esempio: si "clona" un gene in un batterio (ovvero si inserisce il gene di interesse, come quello per l'insulina, in un batterio e lo si fa moltiplicare) in modo che sia il batterio a produrlo. Ad esempio si può usare l'escherichia coli. Il DNA ricombinante deve essere inserito, o trasfettato, in cellule ospiti che in seguito a tale modifica sono chiamate transgeniche. Perché il tentativo riesca è importante la scelta della cellula ospite, che può essere procariotica oppure eucariotica. Una volta scelta la specie ospite, il DNA ricombinante viene messo a contatto con una popolazione di cellule ospiti e, in condizioni opportune, penetra in alcune di esse.

2 Dal momento che tutte le cellule ospiti (non solo quelle in cui è penetrato il DNA ricombinante) si moltiplicano, il ricercatore deve poter stabilire quali contengono effettivamente la sequenza da clonare. Un metodo comune per riconoscere le cellule contenenti il DNA ricombinante è quello di contrassegnare la sequenza inserita con geni reporter, cioè geni dei quali è facile osservare il fenotipo e che quindi servono da marcatori genetici per la sequenza che ci interessa. CLONARE UNA CELLULA: Isolamento di una cellula e quindi delle cellule da questa derivate per mitosi a formare una linea cellulare di elementi identici tra loro. Es: ANTICORPI MONOCLONALI Gli anticorpi monoclonali costituiscono un insieme di anticorpi identici fra loro in quanto sono prodotti da linee cellulari provenienti da un solo tipo di cellula immunitaria (il clone cellulare). PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI Coltivando i linfociti in laboratorio si possono produrre quantità illimitate di un anticorpo desiderato, che può poi essere purificato. Ogni specifico anticorpo, che riconosce uno specifico antigene (epitopo), è prodotto da uno specifico linfocita B. L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali. Tuttavia i linfociti B, quando sono coltivati in vitro, muoiono dopo brevissimo tempo, e quindi non possono essere una fonte per la produzione a lungo termine di anticorpi. La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule

3 mielomatose), utili per le loro caratteristiche di maggior crescita e sopravvivenza. Molte delle risultanti cellule ibride (o ibridomi), che vengono coltivate in vitro, manterranno la capacità di vivere per un tempo più lungo, oltre a produrre grandi quantità dell'anticorpo monospecifico. Antigene iniettato nel topo Cellule tumorali in un terreno di coltura Linfociti B (prelevati dalla milza) Cellule tumorali Cellule fuse insieme per produrre cellule ibride Una cellula ibrida viene posta in un terreno di coltura Anticorpo Coltura di cellule ibride che producono anticorpi monoclonali

4 CLONARE UN ORGANISMO PLURICELLULARE E possibile clonare animali partendo da un nucleo diploide. Nella clonazione riproduttiva di un animale lo scopo è quello di ottenere un individuo esattamente identico a quello di origine. Nella clonazione terapeutica lo scopo è quello di ottenere cellule mature variamente specializzate a scopo terapeutico. Per la clonazione terapeutica si possono usare cellule staminali embrionali o cellule staminali mature.

5 LA CLONAZIONE ANIMALE: I PRO E I CONTRO Pro : 1) La clonazione riproduttiva può essere l unico modo, oggi, per salvare specie gravemente minacciate dall estinzione. 2) La clonazione terapeutica può essere orientata a sviluppare e riparare organi e tessuti, o a combattere malattie. Contro: 1) Il DNA mitocondriale del donatore non viene trasmesso al clone, che può invecchiare precocemente. 2) Nei cloni il tasso di mutazione è più alto e la regolazione dell espressione genica è anomala

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