Recettori di superficie

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1 Recettori di superficie Esistono 3 classi principali di recettori di superficie 1. Recettori annessi a canali ionici 2. Recettori accoppiati alle proteine G 3. Recettori associati ad enzimi

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3 I recettori associati alla tirosina chinasi sono privi di attività catalitica intrinseca, ma il legame con il ligando induce la formazione di un recettore dimerico che interagisce ed attiva delle tirosina-chinasi citosoliche

4 Recettori dotati di attività enzimatica intrinseca possiedono attività tirosin-chinasi stimolata dal ligando. nella maggior parte dei casi il ligando si lega come dimero stimolando la dimerizzazione del recettore e la stimolazione della sua attività chinasica. Questi recettori autofosforilano residui di tirosina presenti nel loro dominio citosolico e possono fosforilare anche varie proteine substrato

5 Recettori di membrana con attività tirosin-chinasica (RTK). Il legame con il ligando induce l attività tirosin-chinasica e la cosiddetta autofosforilazione del dominio citoplasmatico del recettore. Il recettore attivato può anche fosforilare altre proteine substrato.

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7 I recettori tirosina chinasi trasmettono il segnale alle proteine Ras

8 Le proteine Ras sono delle GTPasi che agiscono a valle dei RTK. Analogamente alle proteine G, vengono attivate dalla fosforilazione del GDP a GTP.

9 Le proteine Ras e Ras-like monomeriche determinano l attivazione di una proteina chinasi e la conseguente fosforilazione di specifici substrati. A loro volta, questi causano una specifica risposta cellulare, quale il cambiamento dell attività metabolica, variazioni della struttura e delle funzioni del citoscheletro, oppure la modulazione dell espressione genica.

10 Il recettore attivato dal ligando si lega alla proteina GRB2 la quale interagisce con la proteina Sos questa determina la fosforilazione del GDP, legato a Ras.

11 L attivazione di Ras è mediata da due proteine, GEF (Guanine nucleotide exchange factor) e GAP (GTPase activating protein)

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13 L attivazione di Ras attiva la cascata delle MAP chinasi (Proteine chinasi attivate da mitogeni)

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15 La via delle MAP chinasi può promuovere la proliferazione cellulare, attivando la trascrizione di alcuni geni che codificano per le cicline G1

16 Normalmente l attivazione di Ras è la risposta cellulare ad uno stimolo, mediata dall interazione tra un ligando ed il RTK. Nelle cellule in cui il protooncogene Ras è mutato, la proteina è sempre attiva e la risposta cellulare avviene anche in assenza di ligando.

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20 (C) (B) In An real imaginary cells signals cell feed in which (A)In into signals response a complex are linked to network internal to and of partially external responses redundant signals, by linear a cell interactions, chooses unbranched between the pathways outcome stasis, of of mitosis, stimulation which apoptosis not or easy inhibition. and to predict sometimes Human analytically. cells differentiation. do not function like this.

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23 Controllo del Ciclo Cellulare -Rispondere in modo adeguato ai segnali esterni -Attivazione di enzimi e proteine responsabili della conduzione dei vari processi al momento giusto - Disattivazione alla fine del processo

24 Punti di controllo G1 Start La cellula cresce, aumenta la propria massa Corretta quantità di nutrienti Adeguati segnali extra-cellulari

25 Punti di controllo G2/M La cellula completa l accrescimento Controllo massa Replicazione del DNA completata

26 Punti di controllo Transizione Metafase - Anafase La cellula si preparara alla citodieresi Controllo integrità del fuso mitotico Corretta disposizione dei cromosomi

27 Negli organismi multicellulari la capacità di procedere oltre i diversi punti di restrizione del Ciclo Cellulare è regolata da ormoni e fattori di crescita, che possono stimolare od inibire la divisione cellulare attivando una cascata di reazioni mediate da protein-chinasi citoplasmatiche.

28 Possiamo considerare il controllo del ciclo come la risultante di un delicato equilibrio tra l attività di proteine diverse. Tra di esse sembrano rivestire particolari importanza: Le protein chinasi ciclina dipendenti CDK Le cicline

29 Le protein chinasi ciclina dipendenti CDK Sono enzimi capaci di trasferire un gruppo fosfato da una molecola di ATP ad una specifica proteina bersaglio modificandone la funzionalità. Questi enzimi sono sempre presenti nelle cellule ma non sono sempre attivi: lo diventano grazie alla loro associazione con particolari proteine attivatrici, le cicline

30 Le cicline Sono proteine la cui concentrazione intracellulare varia periodicamente in maniera ciclica ed in modo netto oscillando da zero a valori relativamente elevati che vengono raggiunti in momenti critici del ciclo cellulare. Esse non posseggono attività enzimatica propria, ma la capacità di interagire con proteine-chinasi specifiche predisponendone l attività funzionale

31 Le protein-chinasi dipendenti da cicline sono eterodimeri: le subunità catalitiche sono chiamate chinasi dipendenti da cicline (CDK), poiché la loro attività chinasica dipende dall associazione con una ciclina; Le cicline costituiscono le subunità regolatrici.

32 L associazione di una subunità catalitica (dotata di attività chinasica) con una delle differenti cicline disponibili determina la fosforilazione di proteine target diverse e l attivazione di pathways chimiche specifiche.

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34 Cdk4 Ciclina D e Cdk6 Ciclina D a metà ed alla fine della fase G1 Cdk2 Ciclina E alla fine della fase G1 Cdk2 Ciclina A durante la fase S Cdk1 Ciclina A e Cdk1 Ciclina B durante la fase G2 e la Mitosi

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37 Cell-cycle dependent phosphorylation of Rb Phosphorylation of Rb allows cells to transit the restriction point and enter S phase p p Hyperphosphorylated Rb Rb p p p p Rb p p Restriction point p Rb G0 Quiescent cells Hypophosphorylated Rb p p Rb G1 phase p p p M phase Rb S phase p p G2 phase p p Rb p p

38 Il passaggio attraverso il punto di restrizione G0 richiede l attività del fattore E2F, il quale promuove la trascrizione di geni codificanti le proteine necessarie per la duplicazione del DNA cellulare. Questo fattore è attivato da Cdk2, Ciclina E e Ciclina A. L attività di E2F è inibita dal legame con la proteina Rb ipofosforilata, presente durante la fase M. Le Cdk 4/6, la Ciclina D, e successivamente la Cdk2 e la ciclina E, fosforilano Rb provocando il rilascio e la conseguente attivazione di E2F

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44 I danni subiti dal DNA nucleare sono identificati da un sistema di controllo, attivo durante G1 e G2, che si basa sulla attivazione di p53, un fattore di trascrizione che stimola l espressione di p21 CIP. Questo cyclin-kinase inhibitor (CKI) si lega ai complessi Cdk-Ciclina e li inibisce, causando l arresto del ciclo in G1 oppure in G2 finchè il danno non sia stato riparato

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47 The role of p53 in the cell cycle apoptosis (cell death) p53 UV irradiation leads to cell cycle arrest S phase DNA synthesis G0 Quiescent cells G1 phase M phase G2 phase Growth and preparation for cell division Mitosis

48 In alternativa, se i danni subìti dal DNA sono di notevole entità, la proteina p53 attiva il macchinario apoptotico e determina così il suicidio della cellula.

49 In alternativa, se i danni subìti dal DNA sono di notevole entità, la proteina p53 attiva il macchinario apoptotico e determina così il suicidio della cellula.

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51 LIFE & DEATH The term life describes a combination of phenotypes such as metabolic activity, its restriction to complex structures, growth, and the potential to identically self-reproduce. Death, of course, does not occur in this description. In prokaryotes, death only seems to be a consequence of environmental conditions that are not compatible with the biochemistry and metabolism that accompanies life. In eukaryotes this accidental cell death constitutes the phenotype called necrosis.

52 Okada et al Nature Reviews Cancer 4:

53 Perdita della normale morfologia con diminuzione del volume cellulare, specifica degradazione del DNA e delle proteine, comparsa dei corpi apoptotici ed attivazione della fagocitosi tissutale.

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55 Le pathways coinvolte nella morte cellulare per suicidio sono oggetto di numerosissimi studi e non sono ancora del tutto caratterizzate

56 La morte cellulare programmata è determinata geneticamente (circa 300 geni del nostro genoma) Proteine proapoptotiche (Bax-alfa) Proteine antiapoptotiche (Bcl2)

57 (A) Oocytes with a high level of pro-apoptotic gene expression, possessing an imbalance towards programmed cell death. (B) Oocytes with almost equal distribution of pro- and anti-apoptotic factors suggestive of a balance between survival and death molecule contributions. (C) Oocytes with an excess of anti-apoptotic factors indicative of a strong survival pathway. Distribution of five pro- and anti-apoptotic genes in 15 individual MII stage human unfertilized oocytes obtained from several patients. The expression of Bag-1 (yellow), Bax (orange), Bcl-x (pale blue), Hrk (red) and Mcl-1 (dark blue) was determined using quantitative dot blot RT-PCR. The total amount of gene expression was calculated for these pro-apoptotic (orange and red) and anti-apoptotic (yellow, pale blue and dark blue) genes, each pie piece representing the contribution for that particular gene. The oocytes were then grouped on the basis of their expression profiles.

58 Negli Eucarioti multicellulari il controllo dinamico della morte cellulare per suicidio, in stretta correlazione con quello della proliferazione, oltre ad essere un meccanismo fondamentale durante lo sviluppo embrionale ( (Rimodellamento dell embrione embrione) consente l eliminazione l delle cellule senescenti, danneggiate oppure mutate senza che venga alterato l assetto l fisiologico dell organismo.

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61 APOPTOSI I meccanismi genetici e molecolari dell apoptosi furono identificati per la prima volta nel nematode Caenorhabditis elegans. Basandosi sugli studi eseguiti su questo animale, si è stabilito di suddividere il processo apoptotico in 3 fasi. 1) induzione 2) esecuzione 3) riconoscimento e fagocitosi del corpo apoptotico

62 FASE DI INDUZIONE Le vie indotte possono essere due Via dei recettori della morte Via mitocondriale

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64 Via dei recettori della morte Nella via dei recettori della morte intervengono i legami di specifiche molecole-segnale ai propri recettori posti sulla membrana plasmatica: ad esempio, il legame del recettore Fas col suo ligando Fas-L determinerebbe un avvio del processo apoptotico

65 Via mitocondriale Nella via mitocondriale intervengono i mitocondri, con la liberazione di attivatori delle caspasi come il citocromo C, con cambiamenti nel trasporto elettronico, con l'alterata ossido-riduzione cellulare con la partecipazione della famiglia delle proteine pro- e anti-apoptiche Bcl-2

66 FASE DI ESECUZIONE La fase di esecuzione è comune a quasi tutte le vie d innesco ed è costituita da una serie di reazioni enzimatiche a cascata. Una volta innescata, la reazione non è più arrestabile e procede automaticamente, portando a morte la cellula.

67 RICONOSCIMENTO E FAGOCITOSI Nei tessuti i corpi apoptotici vengono riconosciuti e fagocitati dalle cellule circostanti e dai macrofagi e degradati all interno dei lisosomi. il risultato finale è sempre quello di eliminazione pulita

68 Con la comparsa degli organismi multicellulari, la morte cellulare per suicidio acquista un significato biologico

69 Omologhi di geni coinvolti nella morte cellulare per suicidio sono stati trovati nei protisti, anche se con funzione apparentemente differente. Inoltre forme primitive di morte cellulare non necrotica sono state osservate in alcuni protozoi ed in eubatteri.

70 Caratterizzazione del Macchinario Apoptotico Kroemer et al. (2005) Nature Medicine 11 (7): 725

71 In alcuni casi l avvenire dell apoptosi è programmato, cioè è parte integrante del programma di sviluppo e differenziamento degli organismi (morte cellulare programmata); in altri casi l avvio del processo apoptotico è determinato da eventi accidentali quali: danni subiti dalle strutture e molecole della cellula (e.g., le membrane, il DNA genomico oppure quello mitocondriale, l RNA e le proteine), che non siano di entità tale da causare la morte per necrosi mancanza di fattori trofici, tra i quali i più caratterizzati sono le neurotrofine (e.g., NGF, BDNF e NT-3) che sono essenziali per il corretto sviluppo del sistema nervoso

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73 Alterazioni dell attività di proteine pro o anti apoptotiche possono causare: Malattie neurodegenerative Neoplasie