RISOLUZIONE ENO 26/2004

Transcript

1 MANNOPROTEINE DI LIEVITI L'ASSEMBLEA GENERALE, Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell'accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l'organizzazione internazionale della vigna e del vino Su proposta della Sottocommissione dei metodi di analisi e valutazione dei vini, DECIDE di introdurre nella Raccolta dei metodi internazionali d'analisi dei vini, il metodo seguente: MANNOPROTEINE DI LIEVITI 1. OGGETTO, ORIGINE E CAMPO DI APPLICAZIONE Le mannoproteine sono estratte dalle pareti cellulari dei lieviti Saccharomyces cerevisiae mediante metodi fisico-chimici o enzimatici. Le mannoproteine presentano strutture diverse a seconda della loro massa molecolare, il loro grado e il loro tipo di glicosilazione e la loro carica. A seconda della modalità di estrazione, possiedono diverse attività di stabilizzazione tartarica e/o proteica dei vini. 2. ETICHETTATURA L etichetta deve riportare il campo di applicazione (stabilizzazione tartarica e/o proteica dei vini), le norme di sicurezza e di conservazione, nonché la data di scadenza. Per i preparati in soluzione devono essere indicati inoltre la concentrazione in mannoproteine e il tenore in anidride solforosa. 3. CARATTERIZZAZIONE Le mannoproteine si presentano sotto forma di polvere generalmente microgranulata di colore bianco o beige inodore, oppure in soluzione colloidale di colore giallastro, translucida Le mannoproteine sono solubili in acqua e insolubili nell etanolo. In soluzione precipitano quando si aggiunge 1 volume di etanolo. 3.3 Potere rotatorio Il potere rotatorio specifico si misura a 589 nm ( riga D del sodio) e viene rapportato a una soluzione di mannoproteine di 10 g/l a una lunghezza di 1 dm. 1

2 Alcune mannoproteine il cui potere rotatorio [α] D 20 C è compreso tra 80 e 150 si distinguono dalla gomma arabica il cui potere rotatorio è inferiore a 50. Altri preparati possono differenziarsi soltanto per la composizione centesimale in zuccheri (si veda il punto 4.12). 4. PROVE 4.1 Perdita all essiccazione Mannoproteine in polvere: Mettere 5 g di mannoproteine in una capsula di silice da 70 mm di diametro. Porre in una stufa a C per 5 ore. La perdita di peso non deve essere superiore al 15 % Mannoproteine in soluzione: Mettere 10 g di soluzione di mannoproteine in una capsula di silice da 70 mm di diametro. Portare a 100 C in bagno d acqua per 4 ore e quindi porre in una stufa a C per 3 heures. La quantità di residuo essiccato deve essere almeno del 10%. I limiti fissati qui appresso sono riferiti al prodotto essiccato. 4.2 Ceneri Incenerire il residuo secco a C. Il tenore in ceneri non deve essere superiore all 8%. 4.3 Preparazione della soluzione standard Preparare una soluzione di mannoproteine a 10 g/l in acqua. Nel caso di soluzione di mannoproteine, pesare un quantitativo corrispondente a 5 g di residuo essiccato, evaporare quasi a secco e quindi sciogliere nuovamente in acqua a 10 g/l. 4.4 Metalli pesanti Sulla soluzione standard (4.3) dosare il ferro secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Internazionale. Il tenore espresso in piombo deve essere inferiore a 30 mg/kg. 4.5 Piombo Sulla soluzione standard (4.3) dosare il piombo secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Internazionale. Il tenore in piombo deve essere inferiore a 5 mg/kg. 4.6 Mercurio Sulla soluzione standard (4.3), ma senza evaporare la soluzione, dosare il mercurio secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Internazionale. 2

3 Il tenore in mercurio deve essere inferiore a 0,15 mg/kg. 4.7 Arsenico Sulla soluzione standard (4.3) dosare l arsenico secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Internazionale. Il tenore in arsenico deve essere inferiore 1 mg/kg. 4.8 Cadmio Sulla soluzione standard (4.3) dosare il cadmio secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Internazionale. Il tenore in cadmio deve essere inferiore a 0,5 mg/kg. 4.9 Azoto totale Introdurre 5 g di mannoproteine in un matraccio da mineralizzazione da 300 ml con 15 ml di acido solforico concentrato (R) e 2 g di catalizzatore di mineralizzazione (R). Continuare il dosaggio come indicato nel capitolo II del Codice enologico Nel caso di soluzione di mannoproteine, pesare un quantitativo corrispondente a 5 g di residuo essiccato, evaporare quasi a secco, quindi continuare come descritto in precedenza. Il tenore in azoto deve essere compreso tra 5 e 75 g/kg Analisi microbiologica Flora mesofila aerobia totale Devono essere presenti meno di germi aerobi mesofili in 1 g Coliformi Devono essere presenti meno di 10 UFC/g di preparato Staphylococcus aureus Assenza controllata di Staphilococcus aureus in un campione di 1 g Salmonelle Assenza controllata di salmonelle in un campione di 25 g. 3

4 Escherichia coli Assenza controllata di Escherichia coli in un campione di 25 g Batteri lattici Devono essere presenti meno di 10 4 UFC/g di preparato Muffe Procedere al computo secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Devono essere presenti meno di 50 UFC/g di preparato Lieviti Procedere al computo secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Devono essere presenti meno di 10 2 UFC/g di preparato Polisaccaridi Principio: Misura dell intensità della colorazione mediante fenolo a caldo, in ambiente solforico Prodotti: Soluzione di mannoproteine a 15 mg/l Sciogliere 150 mg di mannoproteine in 100 ml di acqua distillata, quindi diluire questa soluzione all 1% con acqua distillata Soluzione di fenolo a 50 g/l Sciogliere 5 g di fenolo puro in 100 ml di acqua distillata Protocollo: A 200 µl della soluzione da dosare ( ), sono aggiunti 200 µl di fenolo ( ) e poi 1 ml di acido solforico puro (R). Dopo agitazione immediata, i tubi sono portarti in un bagno d acqua a 100 C per 5 minuti e poi raffreddati a 0 C. Dopo il ritorno a temperatura ambiente, l assorbanza viene misurata a 490 nm. La soluzione di riferimento è una soluzione di mannosio a 100 mg/l. (Il tenore in polisaccaridi espresso in mannosio deve essere superiore à 600 g/kg) 4.12 Composizione centesimale in momoneri glucidici Principio: 4

5 Dosaggio enzimatico del glucosio e del mannosio dopo idrolisi acida. Il dosaggio del mannosio è realizzato dopo quello del fruttosio aggiungendo la fosfomannosio isomerasi (PMI) Prodotti: Soluzione di mannoproteine a 5 g/l Sciogliere 500 mg di mannoproteine in 100 ml di acqua distillata Soluzione di acido solforico 5 M Porre 28 ml di acido solforico puro in 100 ml di acqua distallata Soluzione d idrossido di potassio 10 M Sciogliere 46 g d idrossido di potassio in 100 ml di acqua distallata Fosfomannosio isomerasi 616 U/ml Protocollo: Mettere 100 µl della soluzione da dosare ( ) in provette a chiusura ermetica, aggiungere 1ml di acido solforico ( ) e, dopo agitazione, mettere le provette in bagno d acqua a 100 C per 30 minuti e quindi raffredare a 0 C. Dopo il ritorno a temperatura ambiente, aggiungere 1 ml d idrossido di potassio per neutralizzare il mezzo. Si può quindi effettuare il dosaggio del glucosio e del mannosio secondo il metodo descritto nella raccolta. Le mannoproteine devono contenere almeno il 70% di mannosio rispetto ai polisaccaridi totali determinati al punto di Test di efficacia delle mannoproteine riguardo alle precipitazioni tartariche Principio: Determinazione della dose di mannoproteine per ritardare la cristallizzazione del tartrato acido di potassio in una soluzione idroalcolica Prodotti: Acido tartarico cristallizzato: PM = 150,05 Etanolo al 95% Cloruro di potassio: PM = 74,5 Tartrato acido di potassio: PM = Protocollo: Soluzione di mannoproteine a 10 g/l Sciogliere 1 g di mannoproteine in 100 ml di acqua distillata Matrice idroalcolica 5

6 In un matraccio tarato da 1 litro riempito a metà con l acqua distillata, sciogliere: - Acido tartarico: 2,1 g - Cloruro di potassio: 1,1 g - Etanolo al 95 %: 110 ml Omogenizzare e portare a livello con acqua distillata Test: Mettere in 5 matracci tarati da 100 ml dei quantitativi crescenti della soluzione di mannoproteine ( ) ml, e portare a 100 ml con la matrice idroalcolica ( ). Tali quantitativi corrisponderanno a quantità finali di mg/l di mannoproteine. Aggiungere in ogni matraccio 100 mg di tartrato acido di potassio. Mettere in un bagno d acqua a 40 C per 1 ora fino a completa solubilizzazione del tartrato acido di potassio. Riporre i matracci in frigorifero a 4 C. Osservazione dopo 48 ore: Il matraccio testimone contenente 0 ml della soluzione di mannoproteine ( ) presenta cristalli di tartrato acido di potassio. L assenza di cristalli nei matracci conteneti mannoproteine permetterà di valutare la loro efficacia. In ogni caso i cristalli devono essere assenti nella soluzione contenente 400 mg/l di mannoproteine Test d efficacia delle mannoproteine riguardo alle casse proteiche Principio Determinazione della dose di mannoproteine per migliorare la stabilità proteica dei vini Prodotto: Siero albumina bovina (Frazione V) (BSA) Protocollo: Soluzione di siero albumina bovina a 10 g/l Sciogliere 2 g di siero albumina bovina in 200 ml di acqua distillata Soluzione di mannoproteine a 20 g/l Sciogliere 2 g di mannoproteine in 100 ml di acqua distallata Test Mettere 1 ml della soluzione BSA ( ) in 2 matracci tarati da 100 ml; portare ogni matraccio a 100 ml con un vino bianco secco che non si presenti 6

7 torbido al calore (o, se necessario, stabilizzato mediante trattamento alla bentonite in dose adeguata), omogeneizzare. Aggiungere 0 e 1 ml della soluzione di mannoproteine ( ), omogeneizzare. Tali quantità corrisponderanno a dosi finali di 0 e 200 mg/l di mannoproteine. Filtrare su membrana con pori dal diametro di 0,45 µm il testimone e la soluzione trattata. Mettere le soluzioni filtrate in 2 matracci da 50 ml. Mettere i 2 matracci da 50 ml in un bagno d acqua a 80 C per 30 minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 45 minuti, misurare la torbidità delle soluzioni testimone e trattata. La differenza di torbidità tra il testimone e il campione trattato deve essere almeno del 50% Dosaggio nei vini Principio Il dosaggio delle mannoproteine nei vini può essere realizzato dopo la precipitazione mediante etanolo (5 volumi), idrolisi acida del precipitato e dosaggio del mannosio liberato secondo il metodo descritto in allegato. 5. CONSERVAZIONE Le mannoproteine solide hanno una durata di conservazione superiore a 2 anni se sono conservate al riparo dall umidità, in un imballaggio chiuso e in locali temperati. Le mannoproteine sotto forma di soluzioni colloidali pronte all uso devono essere conservate in contenitori ermeticamente chiusi. 7

8 Allegato Principio Dosaggio del mannosio mediante metodo enzimatico Il mannosio è fosforilato come il glucosio e il mannosio: Mannosio + ATP M6P + ADP Dopo dosaggio del glucosio e del fruttosio, il mannosio 6-fosfato viene transformato sotto l azione della fosfomannosio isomerasi (PMI) in fruttosio-6-fosfato. PMI M-6-P F-6-P Il fruttosio-6-fosfato appena formato si trasforma come prima in glucosio-6-fosfato, che viene dosato. Protocollo Mettere 5 ml di vino in un tubo da centrifuga e aggiungere 25 ml di etanolo al 95%, agitare e porre i tubi per 12 ore in frigorifero a 4 C. Il precipitato formato viene recuperato mediante centrifugazione, quindi lavato 2 volte con 10 ml di etanolo al 95%. L idrolisi del precipitato e il dosaggio del mannosio viene realizzato come al Tale dosaggio non consentirà di distinguere le mannoproteine aggiunte dalle mannoproteine naturali. Reagente aggiuntivo, rispetto al metodo di raccolta dei metodi internazionali di analisi dei vini e dei mosti Soluzione 6: fosfomannosio isomerasi (616 U/ml). La sospensione viene utilizzata senza diluizione. Dosaggio Dopo la misurazione di A 3 secondo il metodo di raccolta dei metodi internazionali di analisi dei vini e dei mosti, aggiungere Bianco Dosaggio Soluzione 6 0,02 ml 0,02 ml Mescolare; effettuare la misurazione dopo 30 minuti; verificare l arresto della reazione dopo 2 minuti. (A 4 ) Determinare le differenze di assorbanza: A 4 A 3 corrispondente al mannosio. Per il bianco e il dosaggio. Dedurre la differenza tra l assorbanza del bianco ( A T ) e quella del dosaggio ( A D ) e stabilire Per il mannosio: A M = A D - A T 8

9 Espressione dei risultati Si ottiene Per il mannosio: Cg/l = 0,423x A M Nota: Se le misurazioni sono state compiute alle lunghezze d onda 334 o 365 nm, si ottiene: Misurazione a 334 nm: Per il mannosio: Cg/l = 0,430x A M Misurazione a 365 nm: Per il mannosio: Cg/l = 0,783x A M 9