S.C.D.U. Anatomia Patologica AOU San Luigi Gonzaga Orbassano (Torino) Marcatori molecolari di sensibilità ai trattamenti farmacologici Susanna Cappia
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1 S.C.D.U. Anatomia Patologica AOU San Luigi Gonzaga Orbassano (Torino) Marcatori molecolari di sensibilità ai trattamenti farmacologici Susanna Cappia
2 STESSO TRATTAMENTO FARMACOLOGICO NON RESPONSIVI RESPONSIVI hanno un corredo genetico differente
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4 Marcatori molecolari di sensibilità ai trattamenti farmacologici FARMACO MARCATORI MOLECOLARI COME LI EVIDENZIO? QUALI EVIDENZIO? NEOPLASIA METABOLISMO del FARMACO
5 FARMACO ANTAGONISTI PER LEGAME AI RECETTORI ANTICORPI MONOCLONALI diretti contro la parte esterna di recettori INIBITORI del DOMINIO TIROSIN-CHINASICO INIBITORI di TRASMETTITORI del SEGNALE INIBITORI ORMONALI
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7 Inibitori delle tirosin kinasi approvati per l uso in oncologia Imatinib Erlotinib Gefinitib Sunitinib Lapatinib Bcr-abl, ckit EGFR carcinoma polmone EGFR carcinoma polmone VEGFR,PDGFR carcinoma mammella Altri farmaci Analoghi della somatostatina Rec. somatostatina Antagonisti ormonali Rec. Ormonali (estrogeni)
8 MARCATORE MOLECOLARE
9 COME LI EVIDENZIO? NEL TESSUTO STESSO ESTRAZIONE DAL TESSUTO A LIVELLO DEL GENE ANALISI della SEQUENZA NUCLEOTIDICA FISH A LIVELLO DELL ESPRESSIONE GENICA ANALISI DELL mrna A LIVELLO DELLA TRASCRIZIONE PROTEICA IMMUNOISTOCHIMICA
10 NEL TESSUTO STESSO A LIVELLO DEL GENE F.I.S.H. Fluorescent In Situ Hybridation Ibridazione Fluorescente - In Situ Ibridazione: legame tra DNA/RNA a sequenze complementari costruite(sonde) Fluorescente: sistema di visualizzazione dell ibridazione In Situ: direttamente su materiale cellulare IMMUNOISTOCHIMICA A LIVELLO DELLA TRASCRIZIONE PROTEICA
11 Metodica FISH pretrattamento a caldo pretrattamento enzimatico Incubazione overnigth Lavaggi di stringenza DAPI
12 OSSERVAZIONE al MICROSCOPIO A FLUORESCENZA anomalie numeriche : aumenti - diminuzioni traslocazioni strutturali: inversioni delezioni Cromogenic In Situ Hibridation OSSERVAZIONE al MICROSCOPIO OTTICO
13 ESTRAZIONE DAL TESSUTO F A S E C O M U N E Estrazione del DNA Amplificazione degli esoni critici Visualizzazione del prodotto di PCR (separazione elettroforetica) - RFLP - ASO DOT-BLOT INVERSO - REAL-TIME A LIVELLO DEL GENE ANALISI della SEQUENZA NUCLEOTIDICA GTAATTCGTTACGCGGG metodo diretto metodi post PCR - SEQUENZIAMENTO -- A LIVELLO DELL ESPRESSIONE GENICA ANALISI DELL mrna A LIVELLO DELLA TRASCRIZIONE PROTEICA
14 analisi con enzimi di restrizione RFLP restriction fragment length polymorphism endonucleasi, ricavate da batteri, che legano il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche originando tagli a doppio filamento all interno o in prossimità della sequenza stessa. nomenclatura si basa sul genere e sulla specie del batterio dal quale è stato isolato l enzima stesso Bam HI deriva da Bacillus amylofaciens, Eco RI da Escherichia coli, Hind III da Haemophilus influentiae Eco RI 5'-G AATTC-3' 3'-CTTAA G-5 1- DNA amplificato mediante PCR 2 - sezionato in frammenti di restrizione mediante opportuni enzimi 3 - frammenti di restrizione vengono quindi separati per lunghezza mediante elettroforesi su gel d'agarosio.
15 oligonucleotidi allele-specifici (ASO) SONDE PICCOLE BASI specifiche per singola mutazione Due sistemi -dot blot (DNA sul substrato rigido) -reverse dot blot (sonda sul substrato rigido)
16 oligonucleotidi allele-specifici (ASO) dot blot inverso 1 oligonucleotidi allele-specifici sono legati ad una superficie solida DNA amplificato con metodica PCR 3 3 I prodotti di PCR a doppio filamento vengono separati in singoli filamenti con tampone a ph alcalino e messi a ibridizzare con la superficie spottata con gli ASO L avvenuta ibridazione è rilevata con sistemi immunologici basati su anticorpi anti DNAdoppia elica marcati con biotina e sottoposti a reazione con streptoavidina-enzima 5 Lo sviluppo dell enzima porta ad una reazione cromatica
17 oligonucleotidi allele-specifici (ASO) dot blot inverso RILEVAZIONE ELISA
18 REAL TIME = PCR quantitativa in tempo reale è un metodo di amplificazione (PCR) e quantificazione simultanea del DNA. Si possono usare primer specifici per singola mutazione quantificazione include l'uso di colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA doppio-filamento (ds) e di oligonucleotidi modificati del DNA (denominati sonde) che sono fluorescenti una volta ibridati con un DNA
19 SEQUENZIAMENTO DIRETTO Frederick Sanger ( ) Nobel per la chimica nel 1958 per aver sviluppato le tecniche per la sequenza delle proteine (INSULINA) e nel 1980 per lo sviluppo del metodo per sequenziare il DNA Il metodo Sanger metodo enzimatico nucleotidi modificati si basa sull'utilizzo di (dideossitrifosfato, ddntps) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche. I nucleotidi dideossitrifosfato sono molecole artificiali corrispondenti ai nucleotidi naturali, ma si differenziano per l'assenza del gruppo ossidrilico sul carbonio 2' e 3' della molecola. I dideossinucleotidi, a causa della loro conformazione, impediscono che un altro nucleotide si leghi ad essi, in quanto non si possono formare legami fosfodiesterici
20 Il protocollo classico richiede un templato di DNA a singolo filamento, un primer per iniziare la reazione di polimerizzazione, una DNA polimerasi, nucleotidi deossi e nucleotidi dideossi per terminare la reazione di polimerizzazione. Il campione di DNA da sequenziare viene diviso in quattro reazioni separate, ognuna delle quali contiene la DNA polimerasi e tutti e 4 i deossiribonucleotidi (datp, dctp, dgtp, dttp). Ad ognuna di queste reazioni viene poi aggiunto solo uno dei quattro nucleotidi dideossi (ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp) in quantità stechiometricamente inferiore per permettere una elongazione del filamento sufficiente per l'analisi. L'incorporazione di un dideossinucleotide lungo il filamento di DNA in estensione ne causa la terminazione questo dà origine ad una serie di frammenti di DNA di lunghezza diversa interrotti in corrispondenza dell'incorporazione del nucleotide dideossi. I frammenti generati da queste reazioni vengono poi fatti correre su gel di poliacrilamide-urea che permette la separazione dei vari frammenti con una risoluzione di un nucleotide. Ognuna delle 4 reazioni è corsa su pozzetti vicini, dopodiché le bande sono visualizzate su lastra autoradiografica.
21 Utilizzando un tracciante non radioattivo ma fluorescente si ottengono tracciati che oltre al tipo di nucleotide agganciato ci danno anche la sua frequenza
22 sequenziamento automatico il principio è quello del metodo classico la reazione passa attraverso un capillare che contiene una matrice con la stessa funzione di separazione dei frammenti normalmente svolta dal gel di poliacrilamide. la separazione è simile a quella della cromatografia su colonna: i frammenti di diverse dimensioni si separano e sono rivelati, uno dopo l altro, da luce laser di lunghezza d onda tale da eccitare la fluorescenza dei diversi ddntp Picchi di colore diverso, con aree proporzionali all intensità di emissione SENSIBILITA 20 %
23 PYROSEQUENZIAMENTO sequenziamento per sintesi amplificato primer TGCTCTAGCTACAGTGAAAGTGAAAT ACGAGATCGA
24 FASE DI PCR Primer biotinilato AMPLIFICATO BIOTINILATO B STAZIONE DI PREPARAZIONE Prodotti di PCR immobilizzati sulle biglie di sefarosio ricoperte di streptoavidina Acqua Washing buffer PSQ piastra con primer di sequenziamento
25 PIROGRAMMA DATI QUALITATIVI E QUANTITATIVI GENOTIPO INDICATO DAL SOFTWARE SENSIBILITA 5-10 %
26 Marcatori molecolari di sensibilità ai trattamenti farmacologici MARCATORI MOLECOLARI QUALI EVIDENZIO? NEOPLASIA Neoplasia colon-retto Carcinoma non a piccole cellule polmone Carcinomi mammella Carcinomi pancreas
27 NEOPLASIA DA TRATTARE Carcinoma colon-retto EGFR (ErbB1) è sovra-espresso nel 25%-77% Cetuximab = anti EGFR EGFR IHC non valuta EGFR funzionali Non idoneo a valuatare EGFR targeted therapy
28 FISH MUTAZIONI esone 2 del gene K-ras
29 febbraio 2009
30 Materiale biologico per l estrazione del DNA e l analisi mutazionale di KRAS carcinoma infiltrante primitivo del colon-retto o metastatico biopsie esplorative o tessuto neoplastico asportato con intervento chirurgico fissato in formalina ed incluso in paraffina oppure congelato a -80 C lesioni adenomatose o carcinomatose non invasive vanno escluse
31 Il campione da identificare per la diagnosi molecolare si presenta frequentemente come un tessuto eterogeneo accanto ad aree di carcinoma infiltrante possono essere presenti componenti tessutali normali,aree di necrosi e aree flogistiche La percentuale di cellule di carcinoma infiltrante non deve essere inferiore al 70%. prima dell estrazione del DNA le aree tumorali devono essere accuratamente selezionate mediante dissezioni costosa strumentazione particolare esperienza nel settore specifico MICRODISSEZIONE LASER scarsa quantità e la qualità non ottimale del DNA ottenuto possono favorire l insorgenza di artefatti e quindi falsi positivi uso ricerca
32 MACRODISSEZIONE MANUALE eseguite su fette distese su vetrino o direttamente sul blocchetto di tessuto permettere di arricchire notevolmente il campione di cellule tumorali e di raggiungere, nella maggior parte dei casi, la percentuale di cellule neoplastiche richiesta per l esame MACRODISSEZIONE MANUALE da vetrino 5 sezioni di 20 μm vengono raccolte su altrettanti vetrini portaoggetto in acqua distillata pura in recipienti monouso al fine di evitare inquinamenti fatte essiccare sul vetrino a T ambiente. l area prescelta su sezione colorata con ematossilina-eosina viene delimitata con un pennarello le sezioni in bianco da 20 μm adese al vetrino vengono confrontate con l area selezionata ed opportunamente dissezionate con la lama di un bisturi. Il tessuto dissezionato viene raccolto in un tubo Eppendorf, sottoposto a sparaffinatura in appropriato solvente, lavato in alcool e disidratato prima di iniziare l estrazione
33 MACRODISSEZIONE MANUALE da blocchetto L area è scelta su sezione colorata con ematossilina-eosina viene delimitata con un pennarello L area viene quindi individuata sulla superficie del blocchetto di paraffina corrispondente e su quest ultimo il perimetro della zona selezionata viene inciso con la lama di un bisturi. Si ottengono quindi al microtomo 5 sezioni di 20 μm dell area prescelta Il tessuto dissezionato viene raccolto in un tubo Eppendorf, sottoposto a sparaffinatura in appropriato solvente, lavato in alcool e disidratato prima di iniziare l estrazione
34 L estrazione e la conservazione del DNA metodica classica: estrazione in fenolo-cloroformio e la purificazione mediante precipitazione in alcool kit commerciali basati sulla cromatografia (micro campioni quali piccole biopsie) consentono una standardizzazione delle procedure Una volta estratto, il DNA viene risospeso in tampone adeguato valutato sotto il profilo qualità/quantità mediante lettura spettrofotometrica, o tramite visualizzazione su gel d agarosio. Se conservato opportunamente il DNA può essere usato anche a distanza di tempo (vari anni) (congelatori a -80 C e contenitori di azoto liquido)
35 Raccomandazioni per il protocollo di amplificazione PCR del gene KRAS Le reazioni devono essere allestite in una cappa a flusso laminare, in un ambiente diverso da quello utilizzato per l analisi dei prodotti di amplificazione, impiegando materiali dedicati e con le opportune precauzioni onde evitare contaminazioni (guanti,puntali con filtro, ecc.). Per ogni determinazione devono essere previsti almeno un controllo positivo di amplificazione (campione di DNA genomicoprecedentemente validato) ed un controllo negativo (miscela di reazione priva di templato). Per ogni campione da analizzare è opportuno produrre due diversi amplificati, in modo da effettuare la sequenza di due diversi prodotti di PCR. La reazione PCR deve essere allestita utilizzando ng di DNA genomico, per garantire una buona resa ed evitare artefatti. Ogni laboratorio dovrebbe validare la metodica di PCR/sequenziamento in via preventiva utilizzando diluizioni di DNA mutato in DNA non-mutato da linee cellulari il cui stato mutazionale di KRAS sia conosciuto. La sensibilità della metodica dovrebbe essere tale da individuare mutazioni quando le copie di DNA mutato rappresentano il 25% circa del totale.
36 Refertazione La refertazione è parte integrante della procedure diagnostica. Il referto dovrebbe contenere le seguenti informazioni: L identificazione del paziente e del medico/struttura che ha richiesto l analisi La metodica impiegata per l esecuzione dell analisi Il materiale utilizzato per l analisi e la percentuale di cellule tumorali I risultati del test, con specificazione del tipo di mutazione eventualmente rilevata
37 Mutazione codone 600 scrivere sito mut
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39 NEOPLASIA DA TRATTARE EGFR mutazioni Fattori clinici predittivi: genere femminile non fumatore adenocarcinoma tipo BAC razza est-asiatica gefitinib Erlotinib Carcinoma non a piccole cellule del polmone Adenocarcinoma Carcinoma squamoso Adenosquamoso Grandi cellule Sarcomatoide delezioni regione esone 19 (tra codone 746 e 750) mutazione esone 21 (codone ) mutazione esone 18 (codone 719)
40 proteina - immunoistochimica EGFR - FISH
41 CRITERI DI INTERPRETAZIONE EGFR FISH-POSITIVO: AMPLIFICAZIONE EGFR/CEP7 ratio >2 CLUSTER DI GENI (>4 spots) in >10% CELLULE TUMORALI EGFR FISH-POSITIVO: POLISOMIA >40% cellule >4 coppie di EGFR BASSA POLISOMIA almeno 15 coppie EGFR in >10% di cellule tumorali ALTA POLISOMIA
42 gene EGFR 24 maggio 2010 citologico istologico Cellule neoplastiche 50% quantità DNA da amplificare Pyrosequenziatore Falsi positivi Falsi negativi
43 Altri marcatori molecolari EGFR TKI HER2 mutazioni RAS mutazioni RAS mutato in > 30% NSCL >90% in K-RAS, codone 12
44 PF
45
46 NEOPLASIA DA TRATTARE carcinoma della mammella Recettori ormonali Epidermal Growth Factor Receptor 2
47 Marcatori molecolari di sensibilità ai trattamenti farmacologici FARMACO ENZIMI METABOLISMO del FARMACO TOSSICITA AZIONE
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49 Effetti dei polimorfismi genetici sul metabolismo del farmaco - Metabolizzatori lenti : sono pazienti che presentano una mutazione in entrambi gli alleli del gene, cioè presentano due alleli non funzionali del gene CYP2D6 - Metabolizzatori intermedi: sono pazienti portatori in eterozigosi di una mutazione, cioè presentano un allele normale del gene CYP2D6 ed uno non funzionale -Metabolizzatori estesi: due alleli attivi del gene o un allele funzionale ed uno parzialmente (persone dotate di un normale metabolismo farmacologico) -Metabolizzatori rapidi :sono persone con un aumentata espressione del gene CYP2D6, dovuta alla presenza di tre o più alleli funzionali, a causa di una duplicazione o multiduplicazione di un allele funzionale
50 Terapia con tamoxifene (CYP2D6) IL TAMOXIFENE È UN MODULATORE SELETTIVO DEI RECETTORI PER GLI ESTROGENI (ER) AMPIAMENTE UTILIZZATO NEGLI ULTIMI VENTICINQUE ANNI SIA NELLA TERAPIA ADIUVANTE DELLE FORME DI CANCRO DELLA MAMMELLA ER-POSITIVI, CHE NELLA PREVENZIONE PRIMARIA IN DONNE AD ALTO RISCHIO. Vengono analizzati cinque polimorfosmi nel gene codificante per il CYP2D6. I polimorfismi *3, *5 e *6 sono rappresentati dalla delezione di una A in posizione 2549, dell'intero gene e di una T in posizione 1707 per il *3, *5 e *6 rispettivamente. Il polimorfismo *4 invece è rappresentato dalla sostituzione di una base in posizione Metodo analitico Estrazione del DNA, amplificazione mediante PCR e sequenziamento. Campione richiesto prelievo ematico in EDTA
51 irinotecano trattamento del carcinoma avanzato del colon-retto. variabilità genetica a livello della regione TATA box del promotore del gene UDP-glucorosil-transferasi A1 (UGT1A1). Nella popolazione generale si osservano tre principali genotipi a livello del promotore di questo gene: il genotipo omozigote wild type, caratterizzato da 6 ripetizioni del dinucleotide timidina-adenina e denominato (TA)6/6, il genotipo omozigote mutato con 7 ripetizioni del dinucleotide TA denominato (TA)7/7 il genotipo eterozigote denominato (TA)6/7 che possiede su un cromosoma l allele wild type e sull altro cromosoma l allele con la ripetizione extra. L introduzione del dinucleotide extra determina una diminuizione dell attività enzimatica con conseguente aumento dei livelli del metabolica attivo dell irinotecan ed insorgenza di gravi effetti collaterali. Farmaci antiblastici TAXANI IDENTIFICAZIONE DELLE VARIANTI GENETICHE PER QUATTRO POLIMOFISMI CHE POSSONO INFLUENZARE L ESITO DELLA CHEMIOTERAPIA CON TAXANI CYP3A4*1B e CYP3A5*3 ABCB1 C12336T
52 grazie!
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