Metodi per la misura della contaminazione microbiologica. Milena Mantarro

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Aurelio Rocca
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1 Metodi per la misura della contaminazione microbiologica Milena Mantarro Milano,

2 Batteri Muffe & co Batteri: Microrganismi unicellulari senza membrane intracellulari definite Funghi: Microrganismi unicellulari (Lieviti) o filamentosi (Muffe) con definite membrane intracellulari Condizioni per la proliferazione Acqua, Fonte di Carbonio, Azoto,Fosforo,Zolfo Temperatura, ph Idrocarburi Fuels C N P O S H 2 O Macronutrienti organici

3 Problema di campo La presenza di acqua e la disponibilità di nutrienti favoriscono la riproduzione di una biofilm avente le seguenti caratteristiche: Solvente resistente Oleofilicità Peso specifico simile a quello del gasolio Alta disperdibilità Inconvenienti in campo A temperature generalmente fra 25 e 35 C Formazione di fouling organico all interfaccia acqua carburante Occlusione dei filtri degli impianti di stoccaggio e distribuzione (*) Occlusione dei sistemi di alimentazione dei motori Possibile corrosione (*) L esperienza ha dimostrato che i punti più sensibili sono i filtri degli erogatori di gasolio alle Stazioni di Servizio.

Capire il problema ASTM D 6469-04: Standard Guide for Microbial contamination in Fuel and

4 Capire il problema ASTM D : Standard Guide for Microbial contamination in Fuel and Fuel System IP London 88: Microbial Problem in oil Industry IP London 87 Microbiology of Fuels

5 Analizzare il problema E : Standard guide for Evaluating NonconventionalMicrobiological Tests Used for Enumerating Bacteria Easicult TTc ASTM D e metodo per la determinazione dei batteri acidofili IP 385/99: Determination of viable microbial content of fuels and fuel components ASTM D 4012: Adenosine Triphosphate (ATP) Content of Microorganisms in water

6 EASICULT TTC Pretrattamento del campione Estrazione con acqua (5 ml /100 ml Gasolio) Inoculazione e incubazione Terreno: TTC Agar Incubazione: C per 48 ore

7 EASICULT TTC Batteri Aerobici che crescono su terreni di Agar sottoforma di colonie rosse Limiti del metodo Applicabilità tra 10 3 e 10 7 CFU/ml Incubazione: C per 48 ore Pretrattamento del campione

ASTM D 4412-84 etc Pretrattamento del campione Estrazione con acqua (5 ml /100 ml

48 ore fino ad un max di 21 gg 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml diluitio 10-1 10-2 10-3

8 ASTM D etc Pretrattamento del campione Estrazione con acqua (5 ml /100 ml Gasolio) Inoculazione e incubazione Terreno: Formula nota Incubazione: C per 48 ore fino ad un max di 21 gg 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml diluitio (1:10) (1:100) (1:1.000) (1:10.000) (1: ) 10-6 (1: ) Gasolio SRB

9 ASTM D etc Batteri Aerobici - acidofili Anaerobici - SRB Lettura: Most Probable Number Organism do not appear to be hypersensitive to small amount of oxygen Limiti del metodo Preparazione dei terreni Scarsa affidabilità su campioni a bassa Densità di organismi Pretrattamento del campione Impossibilità di fare un RRT Tempi di risposta lunghi

10 IP 385 Metodo quantitativo Procedura A: applicabile a c.f.u. < /L Procedura B. applicabile a c.f.u. > 25000/L Applicabile direttamente su carburanti con p.eb.< 390 C Determina batteri e funghi

11 IP 385 Procedura Filtrazione del campione Lavaggio con soluzioni specifiche Incubazione a 25 C per 120 ore Terreno di coltura TSA e MEA

Interpretazione dei risultati: Da 0 a 400 UFC/l: contaminazione lieve condizione di normalità

12 IP 385 Lettura e calcolo dei risultati u.f.c/l = CC x 1000 / V CC: numero delle colonie sul filtro V : volume di gasolio filtrato, in ml Interpretazione dei risultati: Da 0 a 400 UFC/l: contaminazione lieve condizione di normalità Da 401 a 1000 UFC/l :contaminazione moderata condizione di allarme Superiore a 1000 UFC/l: contaminazione grave condizione di prossimo blocco dei filtri

13 IP 385 Vantaggi Analisi quantitativa Applicabile per selezioni di biocidi Svantaggi Tempi di risposta lunghi Selettività dei terreni costo dell analisi

14 ASTM D 4012 La concentrazione di ATP è strettamente legata all attività metabolica della biomassa. Procedura Estrazione della ATP Reazione con Luciferin-Luciferasi Determinazione fotometrica ATP + O 2 + D-Luciferina + Luciferasi Ossiluciferina + AMP + CO 2 + Luce Svantaggi Interferenze Soluzioni STD

15 ASTM D 4012 Metodi da campo Vantaggi Portatili Tempi di analisi brevi Svantaggi Interferenze Modalità di prelievo campione

16 Tenere sotto controllo il problema ASTM D : Trattamento con biocidi Standard Guide for Microbial contamination in Fuel and Fuel System Biocida U.f.c./lt (IP385) ufc/lt Shock Biocida 1 Shock Biocida 2 time

Interventi Consigliati Nei casi di contaminazione grave Rimozione dell acqua libera con sistemi di aspirazione o drenaggio Revisione delle

17 Interventi Consigliati Nei casi di contaminazione grave Rimozione dell acqua libera con sistemi di aspirazione o drenaggio Revisione delle eventuali superfici corrose Lavaggio superfici interne dei serbatoi Trattamento dei serbatoi bonificati con biocida al cosiddetto dosaggio di prevenzione

18 Interventi Consigliati Nei casi di contaminazione grave Suggerimenti alternativi per interventi rapidi e meno onerosi Svuotare i serbatoi fino al minimo fisiologico Trattamento dei fondami con biocida a dosaggio shock Controllo a di 24 ore, del campione di fondame per verificare l avvenuta sterilizzazione Trattamento continuo dei serbatoi sterilizzati con biocida al cosiddetto dosaggio di prevenzione

19 Grazie dell attenzione Milena Mantarro Chimec Spa tel. ufficio: cellulare:

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