Semeiotica laboratoristica per lo screening Indicazioni operative e interpretazione dei risultati
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- Silvano Bonetti
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1 GIORNATE PICENE PER LA PREVENZIONE NEI LUOGHI DI LAVORO Semeiotica laboratoristica per lo screening Indicazioni operative e interpretazione dei risultati Colli del Tronto, 17 aprile 2009 Paolo Staffolani Laboratorio Analisi Ospedale Ascoli Piceno 1 L indagine clinica necessita di esami di laboratorio Il laboratorio restituisce i risultati che non garantiscono certezza assoluta causa difetti di sensibilità, specificità, difficoltà di rappresentazione in vitro Tutti aspiriamo alla certezza ma spesso siamo costretti a cimentarci con il dubbio che il percorso di indagine clinica cerca massimamente di dissipare 2 1
2 Aspetti relativi alla tutela Comunque ci si voglia comportare quando il fenomeno di assunzione di sostanze d buso riguarda i singoli, è indubbia la necessità di correre ai ripari quando esso rappresenta rischi evidenti per la società Assume importanza fondamentale l aspetto dell accertamento dello stato di tossico-dipendenza e le procedure utilizzate debbono essere il più possibile sensibili e, al contempo, garantiste 3 Aspetti relativi alle indagini Le difficoltà in ambito anallitico sono legate a - caratteristiche delle sostanze, - variabili individuali, - modalità di raccolta o prelievo, - necessità di ottenimento di un risultato certo indispensabile in ambito medico-legale 4 2
3 Aspetti relativi alle indagini Che cosa vuol dire risultato certo - metodo definitivo, quello che dopo una esaustiva indagine è stato trovato non avere alcuna fonte conosciuta di inaccuratezza e di ambiguità; -metodo di riferimento, quello che dopo esaustiva indagine è stato dimostrato avere inaccuratezza trascurabile in confronto all imprecisione Cromatografia e Spettrometria di massa Documento IFCC del 1979 Approved recommendation on quality control in Clinical Chemistry 5 Aspetti relativi alle indagini Accuratezza Precisione ( CV%) Precisione Inaccuratezza errore sistematico Imprecisione Accuratezza ( CV%) Inaccuratezza Imprecisione 6 3
4 Aspetti relativi alle indagini Specificità Sensibilità Controllo di qualità Tempi di esecuzione Costi strumentazione Addestramento Service on line Riproducibilità Tempi di risposta Risorse umane Trasferimento dati Costi/benefici Dall incastro di tutte le variabili deriva la scelta delle metodiche 7 Indagini immuno-metrichemetriche Conquistano il mercato le metodiche immunometriche di dosaggio - utili alla soddisfazione delle numerose necessità - bisognose di conferma del risultato Sfruttano proprietà basate sul fatto che un analita (Antigene, Ag) può essere legato da un Anticorpo (Ab) suscitato contro l analita stesso Usano gli Ab per rilevare gli Ag o, reciprocamente, gli Ag per rilevare gli Ab 8 4
5 Struttura anticorpale Regione variabile Riconoscimento Antigene Neutralizzazione Agglutinazione i Precipitazione Regione costante Fissazione del complemento Aggancio recettori per le cellule Fattori di legame con Ig 9 Indagini immuno-metrichemetriche Dal substrato, ad opera dell enzima, si libera la sostanza rilevata dal sistema analitico Ab (legato all enzima) che riconosce Ab In presenza dell Ag Ab che riconosce Ag 10 5
6 I M M U N O D O S A G G I tipologie test immuno-enzimatici (EIA, (EIA, ELISA) immunodosaggi in fluorescenza FIA, Fluorescence ImmunoAssay FPIA, Fluorescence Polarization ImmunoAssay immunodosaggi in luminescenza (LIA) LIA, Luminescence Immunoassay 11 Aspetti relativi alle indagini Scelta influenzata dalla necessità di privilegiare caratteristiche di metodo che non sempre è possibile soddisfare contemporaneamente - Sensibilità - Specificità ità - Cut-off o livello decisionale 12 6
7 Sensibilità e specificità SENSIBILITÀ Caratteristica del test che permette la rilevazione di quantità minimali della sostanza oggetto dell indagine SPECIFICITÀ Caratteristica del test che esclude che la sostanza rilevata sia anche minimamente diversa da quella oggetto dell indagine Limiti - similitudini conformazionali e/o strutturali di molte sostanze - natura non specifica egli Ab utilizzati per le rilevazioni 13 Sensibilità e specificità: valutazione T E S T ASSUNZIONE NON ASSUNZIONE positivo vero positivo falso positivo negativo falso negativo vero negativo Sensibilità = VP/tutti quelli che hanno assunto Specificità = VN/tutti quelli che non hanno assunto 14 7
8 Cut - off Limite (modificabile)) al di sotto del quale la concentrazione della sostanza indagata risulta insignificante ai fini dell indagine Limite di determinazione del metodo Limite al di sotto del quale il metodo analitico non è più in grado di rilevare la sostanza o più semplicemente la più bassa concentrazione di sostanza rilevabile dal metodo di analisi 15 Cut - off Strettamente legata al valore del cut-off è la sostanza presente nel calibratore per la costruzione della curva di calibrazione i Positività e negatività di un test sono funzione di questa sostanza e non di eventuali altri metaboliti presenti nell urina Es.: per la Cocaina benzoil-ecgoninaecgonina 16 8
9 Cut - off per test di screening nelle urine Classe di sostanza (ng/ml) Oppiacei 300 Cocaina metaboliti 300 Cannabinoidi (THC) 50 Amfetamine 500 MDMA (Ecstasy = mg) 300 Benzodiazepine 500 Metadone 300 Linee guida ISS e SAMSHA (Substance abuse and Mental Health Service Administration) Uniformazione delle procedure confronto dei risultati 17 Test di screening Privilegio alla SENSIBILITÀ Scopo: esaltare la possibilità di individuare tutti i soggetti che hanno assunto la sostanza Limite: necessità di test di conferma per essere certi che tutti i positivi allo screening abbiano veramente assunto la sostanza (il test di conferma deve dare certezza sulla tipologia della sostanza rilevata, privilegio alla specificità) 18 9
10 Test di screening Perché necessità di conferma STUPEFACENTE Amfetamine Cocaina Cannabinoidi FARMACI A REAZIONE CROCIATA Efedrina, Clorpromazina, Trazodone, Ranitidina, Desipramina, Anestetici locali contenenti cocaina Ibuprofen, Naproxyn, Dronabinol, Oppiacei Rifampicina, Fluorochinoloni, Chinino dell acqua tonica, 19 Amfetamina / Ecstasy Sostanze appartenenti alla classe dei derivati dell amfetamina, caratterizzati dal possedere un sintetici gruppo metilen-diossilico cui è dovuta la psicotossicità. Itre derivati più comunemente usati sono: 3,4-metilen metilen-diossi diossi-metil metil-amfetamina (MDMA) 3,4-metilen-diossi-amfetamina (MDA) 3,4-metilen-diossi-etil-amfetamina (MDEA) 20 10
11 Fattori concorrenti all incertezza analitica Farmacocinetica delle sostanze Variabilità intervallo tra assunzione e dosaggio Differenti preparazioni sostanza da dosare Distribuzione tissutale della sostanza Età del consumatore Variabilità genetiche del metabolismo della sostanza Sviluppo di tolleranze Differenze analitiche dei metodi utilizzati Sensibilità e specificità dei metodi. 21 Sistema di sicurezza di Qualità garanzia in funzione di Adozione di criteri di accettabilità delle curve di calibrazione Verifica dell aderenza del cut-off al metodo e all ambienteambiente diagnostico-terapeutico con cu si interagisce Adozione di QCI e partecipazione a VEQ Inserimento cieco di campioni a concentrazione nota e vicina ai cut-off con elaborazione statistica dei risultati Conoscenza del LOD, limite it di rilevabilità Conoscenza del LOQ, limite di quantificazione riconoscimento del rumore di fondo (noice) nel metodo 22 11
12 Matrici e finestra di sorveglianza classe di sostanza Oppiacei Cocaina metaboliti Cannabinoidi (THC) Fumatori tempo di rilevazione urinaria da 10 ore a 3 gg 2 3gg (per assuntori cronici fino a 22gg) 1 sola volta: 1 4 gg 4 volte/settimana 1 5 gg Assuntori moderati > 12 gg Assuntori cronici > 22 gg Amfetamine Amfetamine 1 3 gg (massimo 9 gg) Metamfetamine 60 ore (massimo 6 gg) MDMA (Ectasy 1 3 gg Metadone 3 gg 23 Matrici e finestra di sorveglianza Sangue, saliva Urine Capelli mesi giorni 24 12
13 Matrici per le indagini Sangue, scarsamente idoneo per - brevità (qualche ora) permanenza sostanze d abuso - procedura invasiva per il prelievo Urine, matrice di elezione per facilità di raccolta anche per grandi volumi, ma impossibile relazione temporale rispetto all assunzioneassunzione facilità di adulterazione (verifica di t, ph, creatinina) nessuna informazione sull abuso cronico 25 Capelli,, saliva, sudore Matrici per le indagini - informazioni su uso nel tempo - prelievo non invasivo - problemi legati a - cinetica di incorporazione della sostanza a causa della velocità di crescita del capello - contaminazione esterna che rende necessari lavaggi con solventi senza però estrazione del contenuto del capello - difficoltà a reperire standard di riferimento 26 13
14 Matrice per le indagini di screening URINE, poiché ai fini dell indagine preventiva - non necessario stabilire rapporto temporale con l assunzione (fondamentale nell accertamento causale dello stato stuporoso) INOLTRE - procedura di raccolta non invasiva - disponibilità di quantità sufficienti per screening e per eventuali controlli con attenzioni i ad evitarne adulterazione e diluizione i i controllo della minzione, rilevazione o determinazione di parametri di convalida t, ph, creatinina, 27 Possibili adulterazioni delle urine Diluizione in vivo (tentativo di diluizione della concentrazione della sostanza d abuso) Alterazione in vitro (candeggina, aceto, prodotti capaci di interferire con le reazioni chimiche o di alterare i metaboliti oggetto della ricerca) Sostituzione del campione 28 14
15 CO N T R O M I S U R E Creatininuria <20 mg/dl adulterato 20 e 40 mg/dl dubbio Peso specifico < 1003 adulterato Temperatura all emissione < 37 C adulterato ph < 3 o 11 adulterato Nitriti > 5 mg/dl adulterato Glutaraldeide presente adulterato 29 EDDP, metabolita primario del Metadone Metadone aggiunto al campione di urina Risultato positivo al test per metadone immodificato Risultato negativo per EDDP Etildene-Dimetil-Difenil-Pinolidene metabolita urinario del metadone 30 15
16 Aspetti relativi alle indagini Indispensabile nei casi, a valenza medico-legale, di positività dello screening il test t di conferma Tecniche di elezione - Gas-cromatografia - HPLC (gas-cromatografia liquida ad alta pressione) - Gas-cromatografia con spettrometria di massa (unisce la sensibilità della cromatografia alla specificità della spettrometria) inaccuratezza trascurabile in confronto all imprecisione 31 Procedure e garanzie nella raccolta e gestione dei campioni raccolta di congruo quantitativo di urine contestuale alla visita effettuata dal Medico competente e sotto la sua responsabilità raccolta effettuata in locali idonei secondo procedure che assicurino l identità del soggetto e, nel rispetto della di lui dignità, l integrità e l autenticità del campione verbale di raccolta sottoscritto dall interessato e attuazione della catena di custodia in caso di trasferimento al laboratorio per la prova di screening catena di custodia per i trasferimenti relativi alle prove di conferma 32 16
17 GARANZIE per il LAVORATORE 33 GARANZIE per il LAVORATORE 34 17
18 GARANZIE per il LAVORATORE GARANZIE per il LAVORATORE 18
19 GARANZIE per il LAVORATORE 37 Giunta Regione Marche Servizio Salute Indicazioni contenute nelle Procedure per gli accertamenti sanitari di assenza di tossicodipendenza o di assunzione di sostanze stupefacenti o psicotrope in lavoratori addetti a mansioni che comportano particolari rischi per sicurezza, l incolumità e la salute di terzi approvate con la conferenza unica Stato/Regioni Organizzazione attuale del Sistema Sanitario Regionale e dell articolazione dei servizi interessati alle presenti procedure 19
20 Giunta Regione Marche Servizio Salute Necessità di contenere i tempi e i relativi costi a carico dei datori di lavoro Necessità di effettuare gli accertamenti nel rispetto della dignità della persona e della riservatezza Necessità del rispetto delle norme di garanzia circa l oggetto dell accertamento e la sua rapportabilità al lavoratore, fatti questi particolarmente importanti per gli eventuali risvolti in contenzioso sia per il lavoratore che per l accertatore e per il datore di lavoro Giunta Regione Marche Servizio Salute Necessità di proporre procedure e accertamenti facilmente accessibili e fattibili che forniscano elementi di valore obiettivo e scientifico e possano fungere da supporto al giudizio del medico competente in modo da ridurre componenti soggettive meno difendibili in sede di opposizione Necessità di tutelare la salute e la sicurezza dei terzi e del lavoratore e di evitare eventuali arbitrarie etichettature di tossicodipendenza o comunque di consumatori di sostanze stupefacenti e/o psicotrope 20
21 ASUR - Zona territoriale 13 - sede di Ascoli Piceno Laboratorio di screening Analisi qualitativa e/o semiquantitativa Matrice biologica, urina Borse di trasporto t refrigerate con controllo della t Ricerca di Amfetamine, MDMA, THC, Eroina, Metaboliti Cocaina, Metadone Metodica immunochimica KIMS (reazione cinetica particelle magnetiche) Sistema di gestione della Qualità QCI eveq regionale Requisiti Accreditamento regionale Tracciabilità di tutte le operazioni Catena di custodia GIORNATE PICENE PER LA PREVENZIONE NEI LUOGHI DI LAVORO Paolo Staffolani, Laboratorio Analisi Ospedale Ascoli Piceno 17 aprile
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