PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 1
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1 LE INFEZIONI DEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE Coordinatore: AMCLI: Cristina Giraldi, UOC Microbiologia e Virologia, Azienda Ospedaliera - Cosenza con la collaborazione di: AMCLI, Giovanni Pietro Gesu, Laboratorio di Microbiologia, AO Ospedale Ca Granda-Niguarda, Liliana Gabrielli Sezione di Microbiologia, DMCSS - Policlinico S.Orsola-Malpighi / Università degli Studi di Bologna, Bologna; Paola Pauri, Laboratorio Analisi Chimico-cliniche e Microbiologia, Ospedale Civile, Jesi; Claudio Piersimoni, coordinatore Gruppo di Lavoro Micobatteri AMCLI, Adriano Anesi, Microbiologia Ospedale Maggiore, Lodi. APSI, Vittorio Sambri, Sezione di Microbiologia, DMCSS - Policlinico S.Orsola-Malpighi / Università degli Studi di Bologna, Bologna; SIMIT : Sandro Vento UOC Malattie Infettive, Azienda Ospedaliera - Cosenza INTRODUZIONE Le infezioni del sistema nervoso centrale sono molto eterogenee sia per l ampio spettro di microrganismi (batteri, virus, miceti, elminti) che le causano, sia per l aspetto clinico. Sulla base delle sindromi cliniche possono essere classificate in: meningiti acute, subacute e croniche, encefaliti acute e croniche, sindrome da lesione occupante spazio, mielite, neurite, radicolite, nevrassiti (queste ultime in particolare sono spesso mediate da tossine batteriche). Meningiti Sono processi infiammatori delle meningi, generalmente di origine infettiva, che possono evolvere, se non adeguatamente trattati, in meningo-encefaliti o in encefalo-mieliti. La meningite acuta nell adulto è caratterizzata da febbre elevata; cefalea gravativa, esacerbata da contatti, movimenti, luci, rumori; vomito cerebrale; rigidità nucale. Sono possibili sintomi di accompagnamento quali: agitazione psicomotoria, delirio, allucinazioni, torpore ingravescente fino al coma, modificazioni del ritmo del respiro. Nel bambino si manifesta con uno o più dei seguenti segni o sintomi: febbre, rigidità nucale, cefalea, irritabilità, letargia, nausea, vomito, fotofobia. Le convulsioni sono più frequenti rispetto agli adulti. Nel lattante si manifesta con irrequietezza, ipercinesia e prominenza della fontanella bregmatica. La meningite batterica costituisce un emergenza medica, neurologica ed a volte neurochirurgica, che richiede un approccio multidisciplinare. L incidenza annuale è di 4-6 casi per adulti (nella fascia di età superiore a 16 anni); Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis sono responsabili dell 80% dei casi. Negli adulti con meningite batterica la presenza della classica triade sintomatologica (febbre, rigidità nucale, confusione mentale) è bassa (44%), ma quasi tutti i pazienti presentano almeno 2 dei 4 sintomi seguenti: cefalea, febbre, rigidità nucale, confusione mentale. Numerosi batteri possono causare meningite (tabella n.1) ed alcuni di questi sono responsabili di tale patologia in condizioni epidemiologiche strettamente in rapporto all età ed a fattori predisponenti (tabella n.2). Il meningococco è presente come colonizzante nel nasofaringe di circa il 5% della popolazione; si diffonde con le goccioline respiratorie emesse con la fonazione, oltre che col contatto interumano diretto. La meningite meningococcica si sviluppa in forma di limitati episodi a carattere epidemico all'interno di comunità chiuse (quali caserme, convitti). Lo pneumococco è la causa più frequente di meningite nell'adulto; particolarmente a rischio sono gli alcolisti, i pazienti affetti da otite, sinusite o mastoidite cronica, gli individui con traumi cranici chiusi con perdita di liquor, i soggetti con polmonite da pneumococco, quelli con anemia falciforme, gli splenectomizzati e, più in generale, tutti gli individui in stato di debilitazione organica. La vaccinazione per Haemophilus influenzae di sierotipo b ha contribuito a diminuire l incidenza delle forme di meningite causate da questo agente eziologico. I germi gram negativi (in genere Escherichia coli, Klebsiella spp. o Enterobacter spp.) possono essere causa di meningite nei soggetti immunocompromessi, dopo interventi chirurgici o traumi del SNC o in seguito a batteriemie generate spesso da cause iatrogene (come nel caso di soggetti anziani portatori prolungati di catetere urinario). La meningite stafilococcica può insorgere in seguito a ferite penetranti del capo, batteriemie (spesso secondarie a forme di endocardite) o interventi neurochirurgici con estese demolizioni della teca cranica. La meningite da Listeria monocytogenes colpisce particolarmente soggetti affetti da insufficienza renale cronica, portatori di patologie epatiche croniche o pazienti sottoposti a trapianto d'organo, a terapie corticosteroidee o citotossiche antineoplastiche. L'incidenza di meningite da E. coli o da streptococco di PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 1
2 gruppo B è principalmente elevata durante i primi due anni di vita, e soprattutto nel primo mese di vita extrauterina. La meningite virale è caratterizzata dall insorgenza acuta di sintomi meningeali e febbre. Al momento dell insorgenza dei sintomi non è possibile distinguere la meningite batterica da quella virale se non con la rachicentesi. Mentre i pazienti affetti da meningite batterica non trattata evidenziano un progressivo deterioramento dello stato mentale, nei casi di meningite virale si osserva più frequentemente una guarigione spontanea. La meningite virale può avvenire a tutte le età, ma è più frequente nei bambini piccoli. Gli agenti eziologici principali (Tabella 1) sono gli enterovirus, responsabili del 46% delle meningiti virali, seguiti da herpes simplex -2 (HSV-2) (31%), varicella zoster (VZV) (11%) e HSV-1 (4%). A seguito dell introduzione del vaccino, l incidenza delle meningiti virali da parotite e da morbillo si è ridotta, mentre sono in lieve aumento le forme da enterovirus. In particolar modo Coxsachie B ed Ecovirus sono la causa più comune. Sebbene questi virus siano normalmente responsabili di infezioni asintomatiche, essi possono anche causare infezioni sistemiche e presentare una propensione per la neuroinvasività. La meningite da enterovirus può essere accompagnata da manifestazioni mucocutanee tra cui vescicole localizzate a livello delle mani, piedi e bocca, epangina e rash maculopapulare generalizzato. Gli HSV sono anch essi causa di meningiti virali spesso come complicazione di un infezione primaria genitale (specialmente da HSV-2) non sempre associata a sintomi clinici. HSV-2 è associato anche alla Sindrome di Mollaret caratterizzata da ripetuti episodi benigni di meningite. La meningite da VZV viene più comunemente osservata in associazione alla riattivazione del virus e può manifestarsi nel 50% dei casi in assenza di lesioni cutanee. Anche l infezione primaria da HIV è un importante causa di meningite; sintomi neurologici possono avvenire nel 17% dei casi di sieroconversione. Citomegalovirus (CMV) è causa di meningite nei soggetti immunodepressi. Agenti virali di meningite coinvolti in forme del viaggiatore e che colpiscono l'uomo quasi esclusivamente nelle stagioni calde, periodo in cui si registra l attività dell artropode vettore sono: West Nile virus (WNV), Saint Louis encephalitis virus, Tick-borne encephalitis viruses (TBE) e Virus Toscana (TOSV). Le meningiti subacute e croniche sono caratterizzate da insorgenza più graduale, febbre meno elevata, frequenti alterazioni neurologiche focali. La meningite subacuta e quella cronica possono conseguire ad infezioni micotiche, tubercolosi, malattia di Lyme e lue. Tra i miceti,cryptococcus neoformans è l'agente patogeno più comune nei pazienti affetti da AIDS e in soggetti con forme neoplastiche che conducano ad uno stato di depressione immunitaria, quali malattia di Hodgking e linfosarcoma. Meno spesso sono in causa Coccidioides immitis, Candida spp., Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp.,e altri miceti del genere Mucor o anche actinomiceti.. Encefaliti Sono processi infiammatori del tessuto cerebrale sostenuti da una causa infettiva, di origine virale, e meno frequentemente, batterica o parassitaria. La diagnosi eziologia è possibile solo nella metà dei casi. I sintomi sono: agitazione psicomotoria, alterazioni dello stato di coscienza e possibili crisi convulsive. Nel lattante generalmente prevale la sintomatologia convulsiva. Le encefaliti possono essere primitive o rappresentare la complicanza secondaria di un'infezione virale o di una vaccinazione. Le forme di encefalite primaria più frequenti sono dovute a: HSV-1, HSV-2, VZV, enterovirus, Influenza A, EBV, CMV. L encefalite da HSV è la più importante encefalite virale con un incidenza di circa 1/milione all anno. Può essere la conseguenza di un infezione primaria o di una riattivazione ed è causata nel 90% dei casi da HSV-1 e nel 10% da HSV-2. I pazienti HIV, a causa dello stato di imunosoppressione, possono sviluppare encefalite soprattutto da: HSV, VZV, CMV. Le encefaliti da arbovirus, trasmesse da zanzare e da zecche (febbre di St. Louis, febbre equina dell'est e dell'ovest, febbre della California, forme neuro-invasive da WNV, encefalite da zecche tick-borne encephalitis ), colpiscono l'uomo quasi esclusivamente nelle stagioni calde, periodo in cui si registra l attività dell artropode vettore. Le encefaliti secondarie, post-infettive o post-vacciniche, riconoscono un meccanismo patogenetico immunomediato. Le principali sono le encefaliti secondarie al morbillo, alla varicella, alla rosolia, o conseguenti in un numero limitato di casi alla vaccinazione antivaiolosa. Queste encefaliti para- o post-infettive (talvolta definite encefalomieliti acute disseminate o ADEM) si manifestano generalmente 5-10 giorni dopo l'esordio della patologia virale sottostante e sono caratterizzate da una lesione a carattere demielinizzazione prevalentemente localizzata in sede peri-vascolare. ADEM si distingue dall encefalite infettiva poiché colpisce più frequentemente i bambini, per l assenza di febbre all inizio dei sintomi e la presenza di segni neurologici multifocali. PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 2
3 Diagnosi differenziale La diagnosi differenziale delle meningiti si pone con emorragia sub aracnoidea, colpo di calore, uremia, acidosi, abuso alcoolico, tetano, leucemie, linfomi, Lupus Erytematosus Systemicus. Diagnosi di laboratorio di meningite o encefalite La diagnosi di laboratorio prevede: esame microbiologico, chimico fisico e biochimico del liquido cefalorachidiano (LCR) indagini di supporto (emocolture, altri esami microbiologici su campioni biologici vari non provenienti dal distretto neurologico, esami sieroimmunologici) Raccolta e trasporto del campione LCR e altri campioni LCR: viene prelevato per puntura lombare (PL) o rachicentesi nello spazio tra la 4^ e la 5^ vertebra lombare, raccolto in provette sterili con tappo a vite e fondo conico. La suddivisione sequenziale in tre aliquote consente di ridurre progressivamente la contaminazione con sangue proveniente dai tessuti perforati durante l esecuzione della puntura lombare. Il campione deve essere raccolto preferibilmente prima dell inizio della terapia antimicrobica e inviato al laboratorio entro minuti dal prelievo e comunque non oltre un tempo massimo di due ore. N. meningitidis,, H. influenzae sono organismi esigenti che non sopravvivono a tempi lunghi di trasporto o variazioni di temperatura. Inoltre, la lisi spontanea delle cellule ed i ritardi possono determinare un conteggio cellulare che non rispecchia la condizione clinica del paziente. Pertanto il laboratorio deve procedere immediatamente al trattamento del campione (esame microscopico, semina, ecc.). Parte del campione deve essere refrigerato (conservazione non oltre le 72 ore) una volta completati gli esami microscopico e colturale e la parte restante congelata a -80 C (conservazione oltre i 6 mesi). Siero: si utilizzano per il prelievo di sangue provette da 7-10 ml. da impiegarsi nella diagnostica sieroimmunologica. Tamponi: i tamponi (nasale, faringeo e vescicolare) devono essere trasportati tramite apposito terreno per la ricerca dei virus e batteri Feci: le feci, per l eventuale ricerca di enterovirus, devono essere raccolte in contenitori sterili. Emocolture: da eseguirsi contemporaneamente al prelievo di LCR, prima dell inizio della terapia antimicrobica Esame del LCR L esame del LCR comprende: a. Valutazione macroscopica del volume, aspetto e colore (limpido, torbido, presenza di sangue, opaco, giallo, rosso, ecc.) Il volume complessivo di liquor dovrebbe essere di circa 8 ml nell adulto (con un volume minimo di 1 ml) e la quantità totale raccolta va distribuita in tre provette. La prima aliquota, di circa 2 ml, va utilizzata per le determinazioni chimiche, la seconda aliquota va immediatamente inviata per la coltura e, successivamente, per l amplificazione genica dei microrganismi sospetti, la terza si utilizza per l esame microscopico e la ricerca diretta degli antigeni microbici. In caso contrario si deve registrare se il volume del campione è sufficiente per tutti gli accertamenti e, se il campione biologico non fosse appropriato. La valutazione macroscopica del LCR prevede la descrizione del grado di torbidità, l eventuale presenza di sangue o di coagulo, ed inoltre, la valutazione del colore al momento dell arrivo e del sopranatante dopo la sua centrifugazione. La presenza di globuli rossi (GR) nel LCR può essere conseguente ad una emorragia intracerebrale o sub-aracnoidea o ad una PL traumatica con contaminazione di sangue periferico. La presenza uniforme dei globuli rossi in tutti i campioni sequenziali 1 e 3 suggerisce una precedente emorragia nello spazio subaracnoideo, mentre la riduzione dei conteggi sequenziali un sanguinamento correlato alla procedura. La xantocromia, colorazione giallognola nel sopranatante del centrifugato, è presente nell emorragia subaracnoidea mentre nel caso di PL traumatica recente, il sopranatante del LCR è di solito di aspetto trasparente e privo di colorazione. b. Valutazione microscopica sul conteggio totale standard delle cellule e differenziale dei leucociti e striscio colorato con Gram ed altre colorazioni Il conteggio totale standard delle cellule e differenziale dei leucociti si esegue sul campione non centrifugato, preferibilmente sull ultimo prelevato, utilizzando una camera di conteggio. I conteggi non devono essere eseguiti su campioni con coagulo. Metodo di conteggio in camera PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 3
4 Colorare il LCR non centrifugato con soluzione colorante quale toluidina, blu metilene o blu Nilo. Se nel LCR è presente sangue, diluire il campione con acido acetico ed attendere 5 minuti prima di trasferirlo nella camera di conteggio. Ciò consente la lisi dei GR e la colorazione del nucleo dei leucociti per la loro differenziazione. Conteggiare e registrare il numero riscontrato di ciascun tipo di leucocita. Per elevati conteggi di leucociti diluire il LCR. Tenere conto del fattore di diluizione ed esprimere il risultato come numero di cellule per litro. Metodo di colorazione differenziale dei leucociti, raccomandato per elevati conteggi cellulari. Preparare un vetrino dal sedimento di LCR centrifugato per 10 minuti a rpm, lasciare asciugare all aria, fissare in alcool e colorare utilizzando un colorante idoneo per definire la morfologia dei leucociti. Conteggiare e registrare il numero di ciascun tipo di leucocita. Tenere conto del fattore di diluizione, esprimere il risultato come numero di cellule per litro. Il deposito da citocentrifugazione (quale Cytospin) permette una più accurata differenziazione delle cellule. Deve essere posta attenzione ad utilizzare un dispositivo sterile se il centrifugato deve essere utilizzato per una colorazione di Gram. Nel LCR la valutazione del rapporto polimorfonucleati/linfociti non è sufficiente ad indicare l eziologia della meningite. Ciò è particolarmente evidente nei neonati o quando il conteggio totale è di oltre 1000 x 10 6 per litro. La meningite virale o tubercolare, associate generalmente a linfocitosi del LCR, presentano nelle fasi precoci dell infezione una predominanza liquorale neutrofila. I pazienti neutropenici non sono in grado di produrre efficienti o caratteristici polimorfonucleati od una risposta di tipo neutrofilo nel LCR. Per la ricerca delle amebe e del C. neoformans sono talvolta opportune prolungate osservazioni, rispettivamente, di un preparato a goccia o di uno con inchiostro di china. Quest ultimo è essenziale in caso di sospetto di infezione criptococcica nel paziente immunodepresso. Striscio colorato con Gram ed altre colorazioni. La ricerca microscopica eseguita sul pellet ottenuto dopo centrifugazione del liquor si basa sulle seguenti colorazioni: Gram e arancio di acridina per la ricerca dei batteri e miceti; Ziehl-Neelsen e auramina-rodamina per i micobatteri, (vetrini fissati alla fiamma); preparato a fresco con aggiunta di inchiostro di china per evidenziare la capsula di Criptococcus neoformans. Nelle meningiti batteriche la sensibilità della colorazione di Gram è compresa tra il 60 e 80% nei pazienti a cui non è stata ancora somministrata una terapia antibiotica, tra il 40 e 60% in quelli già trattati con antibiotici prima del prelievo di LCR. La specificità per N. meningitidis, H. influenzae e varia tra 97 e 98.5 %. E importante porre attenzione alla fase di decolorazione che, per alcuni microrganismi, risulta delicata e può portare a false interpretazioni morfologiche per la perdita del primo colorante. Per aumentare, invece, la colorazione di contrasto, in particolare per H. influenzae è utile l impiego nella seconda fase di fucsina basica. Nel caso di infezione da L. monocytogenes il numero di batteri nel liquor è solitamente basso e pertanto la sensibilità della colorazione è < 50 %. L arancio di acridina è un fluorocromo che si intercala nella struttura dell acido nucleico: con questa colorazione i batteri e i lieviti appaiono rosso vivo, e i leucociti appaiono invece color verde mela pallido. Questo metodo rileva batteri in bassa concentrazione, ma non distingue tra Gram positivi e negativi. Lo stesso preparato può essere sottoposto a colorazione di Gram senza procedere alla decolorazione dello stesso. La colorazione con Auramina-Rodamina è più sensibile del metodi di Ziehl-Neelsen per la messa in evidenza di BAAR c. Indagini chimico-fisiche: determinazione delle concentrazioni delle proteine, albumina, globulina, glucosio e cloruri. In tabella n.3 sono elencate le caratteristiche chimico-fisiche del LCR in condizioni di normalità: d. Ricerca diretta di antigeni batterici e fungini. I batteri che comunemente causano meningite presentano sulla loro superficie antigeni di natura polisaccaridica che possono essere rilevati da test di agglutinazione al lattice (PAL). La loro affidabilità è scarsa e l applicazione di questi metodi risulta fortemente sconsigliata, con la sola eccezione della determinazione diretta nel LCR dell antigene capsulare dello pneumococco, mediante metodo immunocromatografico.,. L antigene criptococcico può anch esso essere rilevato con PAL su siero e LCR. e. Coltura e antibiogramma Centrifugare il LCR ed inoculare ciascuna piastra con il sedimento ottenuto, lasciare asciugare l inoculo prima di diffonderlo con un ansa sterile. Nei campioni coagulati seminare i frammenti del coagulo in ciascuna piastra di agar, se il campione contiene solamente un piccolo coagulo, questo deve essere incluso nella coltura di una piastra di agar cioccolato. La parte di campione non coagulata deve essere seminata in modo normale come precedentemente descritto. I terreni usati routinariamente per la ricerca dei microrganismi esigenti nel liquor sono: agar sangue di montone al 5%, agar cioccolato arricchito e un brodo di arricchimento (TSB o BHI) (può essere usato, come alternativa, specie in caso di prelievo eseguito in orario di chiusura del Laboratorio, un flacone per emocolture da processare poi in automazione). Le piastre devono essere incubate per almeno 72 h PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 4
5 a 37 C in una atmosfera contenente il 5% di CO 2. Piastre di agar Sabouraud, Mac Conkey e Shaedler (in anaerobiosi), possono essere utilizzate rispettivamente per l isolamento di funghi, enterobatteri e anaerobi. In tabella n.4 sono riassunte le indagini dirette per batteri, micobatteri e funghi nel LCR I risultati delle indagini preliminari permettono al clinico di intraprendere una terapia ragionata la cui ottimizzazione (terapia mirata) richiede la determinazione della sensibilità in vitro. Pertanto le colture positive vengono processate per identificare i microrganismi e testarne la sensibilità agli antibiotici. La scelta del metodo da utilizzare per l esecuzione dell antibiogramma deve tener conto del germe isolato e delle indicazioni relative ad ogni associazione farmaco/microrganismo: CLSI o EUCAST. f. Amplificazione dei genomi microbici ed altri potenziali test da utilizzare. I saggi di PCR sono disponibili come possibilità diagnostica per alcuni microrganismi quali: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae e particolarmente utili quando l esame colturale risulta negativo (ad esempio quanto il LCR risulti torbido e sia stata somministrata chemioterapia). Allo stato attuale delle conoscenze tutte le metodiche molecolari basate su amplificazione genica per la messa in evidenza di target batterici in campioni di LCR devono essere considerate di impiego esclusivamente epidemiologico, mancandone l adeguata validazione clinica. I test di amplificazione genica (PCR) sul liquor sono soprattutto utilizzati nella diagnosi di meningite-encefalite virali. L interpretazione del test deve tener conto di terapie virali precoci in grado di determinare risultati falsamente negativi. Nei casi di probabile meningite/encefalite virale (Tabella 5) è raccomandata la ricerca nel liquor del genoma di: enterovirus, HSV-1, HSV-2 e VZV. Nel caso in cui la ricerca del genoma di HSV risulti negativa in presenza di sospetto clinico e risonanza magnetica positivi per encefalite erpetica è consigliata la ripetizione del LCR dopo 3-7 giorni per un ulteriore valutazione molecolare. In presenza di vescicole cutanee o mucose effettuare ricerche colturali o molecolari per HSV e VZV su tampone cutaneo/mucoso. Un risultato positivo non indica necessariamente che il microrganismo isolato sia l agente eziologico dell encefalite/meningite, così come un risultato negativo non lo esclude. Nel sospetto clinico di infezione da Enterovirus ricercare il virus nel tampone faringeo o nelle feci mediante isolamento in coltura e metodiche molecolari. L eventuale positività deve essere interpretata con cautela: nei bambini piccoli la positività nelle feci può essere dovuta a ceppi vaccinici. Nel periodo di attività del vettore artropode, coincidente con la stagione estiva, è indicata la ricerca nel liquor del genoma di Toscana virus e TBE ed eventualmente di WNV nel caso di viaggiatore estero. In questi casi la PCR sul liquor deve essere affiancata alle ricerche anticorpali su siero e liquor (nei casi di encefalite da WNL la PCR su liquor è positiva in meno del 60% dei casi). In presenza di sospetto clinico o di fase epidemica possono essere indicate le ricerche sierologiche di: parotite, morbillo, rosolia, HIV, EBV ecc. Altri potenziali test da utilizzare in questi casi sono illustrati in Tabella 5. Un eventuale positività della PCR per EBV su liquor non denota necessariamente un infezione del SNC poiché potrebbe essere in relazione alla presenza nel liquor di cellule mononucleate che ospitano il virus latente. Nel soggetto immunodepresso è necessario effettuare la ricerca nel liquor del genoma di CMV e JCV. Emocolture e altri esami microbiologici su campioni biologici vari Viene raccomandata l esecuzione di n.3 emocolture in tutti i casi di sospetta meningite. Può risultare utile l esecuzione del tampone faringeo, soprattutto nei casi con emocoltura o coltura del LCR negative per precedente terapia antibiotica. Diagnosi di laboratorio di meningite batterica (settica: LCR torbido), approccio diagnostico nella probabile meningite virale e probabile encefalite virale La meningite batterica è frequentemente associata a livello del LCR: - concentrazione del glucosio: <60% del glucosio ematico (rapporto LCR: siero = < 0.6) - concentrazione proteica elevata - aumento dei globuli bianchi con prevalenza di polimorfonucleati - pressione intracranica elevata Le caratteristiche del LCR predittive di meningite batterica con una probabilità superiore al 99% (Spanos A. JAMA 1989) sono: glicorrachia < 34 mg/dl, rapporto glucosio siero/lcr< a 0.21, leucociti> 2000/mmc e PMN > 1180/mmc, proteine > 220 mg/dl Nelle meningoencefaliti di natura virale il LCR presenta proteine aumentate, conta cellulare con prevalenza di linfomonociti e compresa tra > 5 < 500 GB/mL (la linfocitosi potrebbe essere assente all inizio dell infezione). I livelli del glucosio sono generalmente normali o bassi in corso di infezione da virus parotitico, HSV, enterovirus, PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 5
6 HIV, WNV e LCMv. All esame microscopico potrebbero essere presenti emazie, soprattutto nelle encefaliti causate da HSV. In tabella n.5 viene indicato l approccio diagnostico raccomandato nei casi di probabile meningite o encefalite di natura virale. Diagnostica microbiologica della meningite tubercolare Il SNC non è mai sede di infezione primaria da Mycobacterium tuberculosis complex. La meningite tubercolare è di solito causata dalla rottura di un tubercolo subependimale nello spazio subaracnoideo piuttosto che dalla diffusione ematogena alle meningi. La meningite tubercolare è più correttamente una meningoencefalite, accompagnandosi sempre alle manifestazioni a carico delle meningi anche lesioni a carico dei vasi dell encefalo. Il quadro clinico della meningite tubercolare è quasi sempre subdolo e spesso atipico; nella maggioranza dei casi la sintomatologia conclamata si manifesta quando l essudato ha raggiunto quantità cospicue ed è in via di organizzazione. Risulta perciò importante affiancare alle metodologie classiche nuove tecnologie in grado di permettere una precoce identificazione dei micobatteri e conseguentemente un tempestivo inizio della terapia specifica. Raccolta e trasporto campione LCR Il volume minimo di liquor necessario per eseguire una ricerca completa è di 2 ml. Nel caso in cui tale volume non fosse disponibile bisogna procedere privilegiando i metodi più sensibili, quindi prima viene la coltura, poi l amplificazione (DAT) ed infine la microscopia. Il liquor per la ricerca dei micobatteri va raccolto in un contenitore sterile ed inviato al laboratorio a temperatura ambiente. Procedura operativa Il liquor non va sottoposto alla procedura di decontaminazione, usualmente praticata ai campioni per i quali è richiesta la ricerca dei micobatteri. Microscopia I campioni devono essere così trattati: centrifugare 0,3 0,4 ml il liquor ad almeno 3000 g x minuti; prelevare il sedimento; porre una goccia dello stesso preferibilmente su un vetrino dotato di pozzetto centrale (immunofluorescenza), asciugare, aggiungere sulla stessa un altra goccia di sedimento e asciugare (almeno tre o quattro vetrini); colorare con le colorazioni classiche Ziehl-Nelsen, Kinyoun, o Auramina. Coltura Data la bassa carica di micobatteri presenti nel liquor e la scarsa sensibilità dei terreni solidi, il loro uso è pressoché inutile. E preferibile associare due terreni liquidi (0,5 ml x 2), meglio se di tipo diverso (radiometrico e non radiometrico) caratterizzati da una più rapida detection. Per il riconoscimento degli isolati, l appartenenza al gruppo M. tubercolosis complex può essere desunta dall aspetto microscopico in coltura (aspetto a fasci), ma va sempre confermata con metodi molecolari (DNAprobe oppure test di ibridazione inversa). Amplificazione In caso di fondato sospetto clinico, eseguire il DAT utilizzando un test commerciale dotato di controllo interno di amplificazione (0,5 ml). Sebbene i test commerciali non siano validati su campioni extrapolmonari, la loro elevata specificità ci consente di assegnare un considerevole valore diagnostico ad un risultato positivo. Un risultato negativo non esclude la meningite tubercolare. REFERTAZIONE LCR Aspetto: refertare l aspetto del LCR e l eventuale presenza di coaguli Microscopia: conteggio cellulare Refertare il numero di GR /ml Repertare il numero di GB/mL Refertare il numero di PMN e linfociti come percentuale del conteggio totale dei GB/mL Colorazione Gram Descrivere i microrganismi osservati Descrivere i funghi dotati o non dotati di capsula osservati Descrivere la presenza BAAR Descrivere la presenza di parassiti Tempo per referto microscopico PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 6
7 Risultati microscopici urgenti possono essere trasmessi per via telefonica o informatica Referto scritto, ore Colture Refertare i microrganismi isolati o Refertare assenza di crescita Refertare anche i risultati delle prove supplementari Tempo di refertazione della coltura Risultati di colture clinicamente urgenti possono essere trasmessi per via telefonica o informatica quando disponibili Referto scritto intermedio / finale, ore segnalando, se appropriato, l invio di un referto successivo. Risultati della PCR (se disponibili): DNA o RNA non rilevato.dna o...rna rilevato con tecnica di PCR NB: l infezione da virus non può essere esclusa da una PCR negativa Ricerche supplementari, Mycobacterium tuberculosis, funghi e parassiti Prove di Sensibilita agli Antibiotici Refertare le sensibilità ai vari farmaci saggiati secondo le linee guida internazionali (CLSI EUCAST) per ogni associazione farmaco/microrganismo Bibliografia - Beaman MH, Wesselingh SL, Acute community-acquired meningitis and encephalitis MJA Practice Essentials Infectious Diseases Vol April Forbes, BA: Clinical and Laboratory Standards Institute, Clinical and Laboratory Standards Institute. Laboratory detection and identification of mycobacteria: approved guideline. M48-A. - Ihekwaba UK et al. Clinical Features of Viral Meningitis in Adults: Significant Differences in Cerebrospinal Fluid Findings among Herpes Simplex Virus, Varicella Zoster Virus, and Enterovirus Infections Viral Meningitis in Adults CID 2008:47 - Logan SAE and MacMahon E, Viral meningitis BMJ 2008:336; Nigrovic LE et al. Clinical prediction rule for identifying Children with cerebrospinal fluid pleocytosis at very low risk of bacterial meningitis. JAMA, January 3, 2007 Vol Kennedy PGE Viral encephalitis: causes, differential diagnosis, and management J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2004;75; Perkins MD, Mirrett S, Reller LB. Rapid bacterial antigen detection is not clinically useful J Clin Microbiol 1995;33: Spanos A, Harrell FE Jr, Durack DT Differential diagnosis of acute meningitis. An analysis of the predictive value of initial observations JAMA Nov 17;262(19): Steiner I et al. Viral encephalitis: a review of diagnostic methods and guidelines for management European Journal of Neurology 2005, 12: Tunkel AR et al. Practice guidelines for the management of bacterial meningitis, Clin Infect Dis 2004 Nov 1;39(9): Werner V, Kruger RL. Value of the bacterial antigen test in the absence of CSF fluid leukocytosis Lab Med 1991;22: Tunkel AR, Glaser CA, Bloch KC, Sejvar JJ, Marra CM, Roos KL, Hartman BJ, Kaplan SL, Scheld WM, Whitley RJ; Infectious Diseases Society of America. The management of encephalitis: clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis Aug 1;47(3): PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 7
8 MENINGITI BATTERICHE Agenti eziologici più comuni Altri agenti eziologici meno frequenti Altri microorganismi considerati cause occasionali MENINGITI VIRALI Agenti eziologici più comuni Elenco dei microrganismi responsabili di meningiti acute H. influenzae N. meningitidis S. aureus S. epidermidis (CoNS) E. coli K. pnemoniae P. aeruginosa Nocardia spp. Streptococchi viridanti Enterobacter spp. Proteus spp. Citrobacter spp. Micobatteri non tubercolari Borrelia spp. Rickettsiae Echovirus (Coxsackie ed ECHO) Virus della coriomeningite linfocitaria Virus del Morbillo Herpes simplex virus Adenovirus Tabella n.1 L. monocytogenes S. agalactiae Flavobacterium spp. Moraxella spp. Propionibacterium acnes E. faecalis Salmonella spp. Streptococchi di gruppo A Serratia spp. Acinetobacter spp. P. multocida. Leptospira spp. Brucella spp. Naegleria spp. Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Varicella-zoster virus Arbovirus (WNV, TBE, Virus Toscana) HIV EBV Virus della Rosolia PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 8
9 Batteri responsabili di meningiti acute in rapporto all età e a fattori predisponenti Età microorganismi Fattori predisponenti 0-4 settimane S. agalactiae E. coli o altri Gram neg. L. monocytogenes Colonizzazione del canale da parto alla nascita Colonizzazione del canale da parto alla nascita Colonizzazione del canale da parto alla nascita Condizione di asplenia anatomica o funzionale 1-3 mesi E. coli H. influenzae L. monocytogenes N. meningitidis S. agalactiae 3 mesi - 18 anni H. influenzae N. meningitidis anni N. meningitidis > 50 anni L. monocytogenes Non all età pressione aspetto leucociti correlati Enterobacteriaceae S. aureus P. acnes Colonizzazione (infezione nosocomiale) Perdita LCR, sinusiti, otiti Immunodeficienza Immunodeficienza, deficit C Colonizzazione cutanea o mucosa (infezione nosocomiale) Perdita LCR, immunodeficienza (3 mesi - 6 anni) perdita LCR, sinusiti, otite media, asplenia anatomica o funzionale Epidemie, asplenia, deficit C, perdita LCR, sinusiti, otite media, asplenia Epidemie, asplenia, deficit C Perdita LCR, sinusiti, otite media, asplenia, alcolismo Immunodeficienza, diabete mellito Perdita LCR, sinusiti, otite media, asplenia, alcolismo, patologie metaboliche, stati di debilitazione organica Intervento neurochirurgico, infezione ospedaliera Intervento neurochirurgico, perdita LCR, endocardite, ascessi, infezione ospedaliera Intervento neurochirurgico, perdita LCR Tabella n.2 Caratteristiche del LCR in condizioni di normalità (posizione seduta) / (decubito laterale) cm H 2 O Limpido, incolore, trasparente Neonato 0 30 cellule x 10 6 /L Età 1-4 anni 0-20 cellule x 10 6 /L Età 5 anni - pubertà 0-10 cellule x 10 6 /L Adulti 0-5 cellule x 10 6 /L Neonato cellule x 10 6 /L eritrociti Adulti 0-10 cellule x 10 6 /L proteine Neonato 6 giorni mg/dl Altri mg/dl (< 1% della concentrazione proteica del siero) albumina mg/dl globuline mg/dl glucosio 60% della concentrazione plasmatica determinata contemporaneamente (rapporto LCR/siero 60%) cloruri mg/dl Tabella n.3 PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 9
10 Ag. eziologico Microscopia Microscopia a fluorescenza Batteri Gram Arancio di acridina Microscopia (colorazione negativa) Antigeni solubili coltura Amplificazi one genica Da eseguire solo per la ricerca di antigene pneumococcico (metodo immunocromatogr afico) AS, AC, TSB, BHI Micobatteri Auramina - LJ, terreno liquido Funghi per Associazione emocoltura micobatteri Inchiostro di +++ Saburaud china per funghi + = poco indicata +++ = molto indicata AS = agar sangue TSB = trypticase soy broth AC = agar cioccolato LJ = Lowenstein-Jensen MGIT= micobacteria growth indicator tubes Tabella n.4 Probabile Meningite /Encefalite Virale Eziologia Test di riferimento Altri potenziali test da utilizzare HSV 1-2 VZV LCR PCR LCR PCR Sieroimmunologia: HSV 1 e HSV2 Isolamento, PCR, DFA, ME: scraping lesioni Isolamento, PCR, DFA, ME: scraping lesioni cutanee enterovirus LCR PCR Isolamento e RT PCR: tamponi faringei o feci virus Toscana e WNV (in periodo di attività dei vettori ematofagi) virus della parotite, morbillo e rosolia IgG e IgM su siero e liquor; LCR PCR IgG e IgM su siero PCR : tamponi orali, urine, sangue EDTA, saliva HIV Test di screening combinato HIV viral load (plasma, LCR) Epstein Barr virus VCA IgM e IgG, EBNA IgG LCR PCR CMV, JC virus (nei soggetti immunodepressi) LCR PCR Tabella n. 5 PD AMCLI infezioni sistema nervoso centrale 10
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